趙仁欣 李森業 郭瑞星 曾新華 文 靜 馬朝芝 沈金雄涂金星 傅廷棟 易 斌,*

1華中農業大學植物科學技術學院 / 作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430000; 2中國農業科學院油料作物研究所, 湖北武漢430062

目前可在中國種業網的大數據平臺(http://139.129.194.173:9100/home/ManageOrg)上查詢到的油菜保護品種有634個, 其中登記品種有185個, 往年國家冬油菜的區試品種約有 180個。油菜種質基礎的狹小導致育成的新品種間的遺傳差異越來越小[1],而如今油菜品種數目越來越多, 如何有效管理和鑒別成為油菜品種管理與市場化的首要難題。2017年5月1日《非主要農作物品種登記辦法》頒布實施, 油菜被列入第一批非主要農作物登記目錄, 油菜由審定品種的事前監管變成了登記品種的事中事后監管[2],只要符合DUS基本條件, 經試驗確定品種特征特性和適宜推廣范圍, 且不存在嚴重安全問題的油菜品種皆可登記, 由此更將增大油菜品種市場化規范管理的難度。開發基于SNP標記的、滿足國家或行業標準的、能為政府品種管理部門提供標準樣品的甘藍型油菜DNA指紋圖譜顯得十分重要。

SNP標記作為第三代分子標記, 不僅具有數量多、分布廣、分型簡單、適用于大規模試驗及等位基因頻率易估計等優勢[3], 而且能與DNA芯片技術相結合進行高通量的檢測分析, 使試驗結果更加準確可靠[4]。SNP標記已廣泛運用于種質資源的遺傳多樣性、類群劃分及品種鑒定的研究, 史亞興等[5]用1059個SNP標記將39份不同基因型的糯玉米自交系劃分五大類群, 明確了其親緣關系; Singh等[6]采用SC基因50K水稻SNP芯片, 研究了包括野生稻、傳統水稻品種和遺傳改良水稻品種在內的 128種不同種質資源間的遺傳多樣性和系統發育關系;Zhao等[7]用44 100個SNP標記對82個國家的413份不同的水稻品種進行基因分型, 將其按連續兩季的表型、生長情況、農藝性狀等系統性地劃分為34類; 侯莉娟等[8]對獲得的 41 843個 SNP標記建立HRM基因分型方法將羊草的48份種質區分開并繪制了相應的指紋圖譜; 北京市農林科學院玉米研究中心利用Maize SNP384 芯片完成4632份審定玉米品種的SNP指紋庫構建[9]; Chen等[10]利用Rice 6K芯片對從東北市場收集的19份可能為“稻花香”的品種進行基因指紋檢測, 發現有6個品種與稻花香2號差異較大, 13個品種為稻花香2號或其近似品種。眾多研究都表明, 利用SNP標記構建甘藍型油菜新品種 DNA指紋圖譜是可行且有效的, 本研究利用Illumina公司聯合世界16家科研單位發行的含有52 157個SNP位點的油菜60K SNP芯片[11]對2016—2017年度國家冬油菜區試參試品種(系)做分析鑒定,以期構建我國冬油菜參試品種DNA指紋圖譜, 為甘藍型油菜品種 DNA指紋數據庫的建立奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 油菜品種

參試材料為2016—2017年度國家冬油菜參試品種187份, 包含續試品種33份(表1)。所用實驗材料皆由中國農業科學院油料作物研究所2016年12月提供。其中, 隨機選取8個品種華油雜29、圣光158、秦優 1618、陜油 1609、陽光 161、蓉油 29、中油153、雜優 15進行 2次重復點樣, 對照進行實驗誤差分析, 即2016—2017年度的冬油菜試驗品種191份材料, 2015—2016年度的冬油菜試驗品種33份材料, 共224份樣品同時進行DNA提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 使用新型植物基因組 DNA提取試劑盒(離心柱型, TIANGEN DP320)進行DNA提取, 取油菜的幼嫩子葉 300～500 mg, 用液氮急凍后充分研磨, 按照試劑盒說明書的操作步驟, 提取油菜基因組DNA, 置于-20℃保存備用。

1.2.2 DNA凝膠電泳檢測 用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測, 每孔點樣10 μL, 200 V電壓電泳15 min左右, 取出膠體在凝膠成像儀上照相留存。瓊脂糖電泳須有大于 10 kb的明亮單一條帶, 對主帶不明顯或者沒有主帶的樣品重新取樣提取DNA。

1.2.3 DNA濃度測定 用NanoDrop 2000測定提取的基因組 DNA質量, 確保基因組總 DNA的A260/A280值在 1.8～2.0之間, A260/A230值在 1.8～2.2之間, 稀釋 DNA 濃度至 50 ng μL–1。

1.2.4 油菜60K Illumina Infinium SNP芯片基因分型 使用高密度的油菜 60K Illumina Infinium SNP芯片進行基因分型分析, 嚴格按照芯片操作手冊的步驟要求進行DNA樣品預處理(擴增、片段化、富集、回收、變性)、DNA樣品與芯片雜交、洗脫、單堿基延伸、染色、洗滌、包埋。然后利用Illumina公司的芯片掃描儀HiScan掃描分型。

1.2.5 數據處理與分析 用 Genome Studio genotyping software v2011軟件對掃描所得原始數據進行分析、篩選。使用Center for System Genomics

在線網址(http://visualization.ritchielab.psu.edu/home/index)繪制所選 SNP標記在油菜全基因組的位置分布圖。用PowerMarker V3.25軟件分析篩選的SNP標記的遺傳多態性信息指數(PIC)、最小基因頻率(minor allele frequency, MAF), 并計算Nei遺傳距離,結合MEGA軟件繪制NJ聚類圖。

表1 2016–2017我國冬油菜試驗品種名稱和編號Table 1 2016–2017 winter-type rapeseed varieties test name and number

(續表 1)

2 結果與分析

2.1 篩選SNP標記與構建指紋圖譜

油菜60K芯片共含有52 157個SNP標記位點,均勻分布在油菜全基因組中。使用 Genome Studio genotyping software v2011軟件進行原始數據處理,224份樣品中 Call Rate值大于 0.80的樣品數量占92%。剔除AA或BB基因型頻率為0、最小基因型頻率(minor freq)小于0.05、SNP得率(call freq)小于0.80、缺失率大于5%的SNP標記后, 得到7457個SNP位點。最后根據分型圖手動剔除分型離散雜亂、3種基因型分型邊界不明顯的(圖1-A)或雜合群與純合群相互重疊的(圖1-B)及出現偏移的(圖1-C) SNP標記, 選取出分型清晰、分型質量高的(圖1-D) SNP標記 5374個。用 PowerMarker V3.25軟件計算得,5374個 SNP標記的 PIC均值為 0.27, 變化范圍是0.09～0.41, 其中A基因組PIC均值為0.26, C基因組PIC均值為0.27, 略高于A基因組, PIC值大于0.25的占55.94%。

將篩選出的5374個SNP標記進行連鎖群比對,有5143個SNP標記比對到了A1～A10、C1～C9連鎖群上, 使用Center for System Genomics的在線網址繪制SNP位點物理位置分布圖可見, 所選SNP標記比較全面地覆蓋了油菜的基因組(圖2)。

利用5374個核心SNP標記組合, 以標記名稱為前綴, 品種在該標記處芯片分型所得的堿基類型為后綴, 得到品種該標記的特征編號。固定標記順序,分別串聯每個品種的標記特征編號, 構建 191份我國冬油菜參試品種的特征 DNA指紋圖譜(本文未列出)。

圖1 基于Genome Studio分析的不同類型的AA、AB、BB基因型的分型圖Fig. 1 Different patterns of clustering of AA, AB, and BB genotypes based on Genome Studio analysisA: 3種基因型分型邊界不明顯; B: 雜合群與純合群相互重疊; C: 3種基因型向一側偏移; D: 3種基因型分型界限明顯。A: SNPs did not show three clearly defined clusters; B: AB cluster overlapped with AA/BB cluster; C: the genotype cluster intensities are shifted to one side of the theta space clusters shift; D: SNPs show three clearly defined clusters.

圖2 5143個SNP標記在油菜基因組的位置分布圖Fig. 2 Genome-wide distribution of 5143 SNPs in physical map

2.2 誤差分析

隨機選取 8個品種華油雜 29、圣光 158、秦優 1618、陜油 1609、陽光 161、蓉油 29、中油 153和雜優 15進行 2次重復點樣對照實驗, 利用Power Marker V3.25軟件計算其Nei遺傳距離, 取8組對照的平均值作為本次實驗的技術誤差, 如表2所示, 得出Infinium芯片的技術誤差為0.36%,與Illumina公司公布的0.1%的技術誤差十分接近,誤差分析結果表明, 本次研究的基因分型結果準確可靠。

2.3 品種間遺傳相似系數分析

用Power Marker V3.25軟件計算191份甘藍型油菜材料的Nei遺傳距離獲取到18 145個遺傳相似系數, 變幅為52.17% (大地192和黔油37) ～99.98%(華油雜12和華油雜12, 不同參試小區的同一品種),平均遺傳相似系數為76.20%。繪制18 145個遺傳相似系數的正態分布圖(圖 3)可知, 相似系數值在90%～93%區間的有 16個, 在 93%～95%區間沒有,在 95%～100%區間的有 22個(其中 2個來自不同品種間, 20個來自同一品種的對照實驗)。可見, 在《油菜品種區域試驗技術規程》中規定的SSR標記的品種特異性的鑒定閾值93%并不適合于SNP標記的品種特異性鑒定, 而農業部頒布的《水稻品種鑒定SNP標記法(NY/T 2745-2015)》中是以品種間遺傳相似系數 95%作為閾值, 即品種間遺傳相似系數≤95%判定為“不同品種”, 品種間遺傳相似系數＞95%判定為“近似品種或疑同品種”, 故在本研究中也以遺傳相似系數 95%作為品種特異性及一致性鑒定的閾值。

表2 8組點樣對照品種的差異系數Table 2 Variation coefficient of eight groups of varieties with two replicates

圖3 2016–2017年度國家冬油菜參試品種相似系數分布Fig. 3 Distribution of genetic similarity coefficients for the 2016–2017 national winter-type rapeseed variety trial

2.4 2016—2017年度國家冬油菜區試品種(系)特異性分析

利用篩選的 5374個 SNP標記分析 187份2016—2017年度國家冬油菜參試品種(系)共 191份材料的遺傳多樣性, 繪制 NJ聚類圖(圖 4)。由圖 4可以看出, 2016—2017年度國家冬油菜區試品種(系)的大部分品種的遺傳相似系數差異明顯, 且同一品種都能聚到一起, 誤差小, 可信度高; 以相似系數95%為閾值(以紅線標注), 191份材料中有2對品種的相似系數大于95%, 分別為秦榮5號和秦優1699(96.76%)、湘雜油373和湘油422 (98.12%), 此4個品種特異性低, 可判定為疑似近似品種, 其余品種間相似系數均小于 95%, 可判定為不同品種。總體而言, 2016—2017年度國家冬油菜參試品種(系)具有較高的特異性。

2.5 2016—2017年度國家冬油菜續試品種(系)一致性分析

將續試品種的種子與前一年送檢的種子同時進行DNA提取, 計算品種年度間的相似系數, 檢測品種是否存在替換現象。2016—2017年度國家冬油菜參試品種中包括 33份續試品種, 利用篩選獲得的5374個SNP標記對33份續試品種共66份材料進行聚類分析(圖5), 大多數品種的2年材料都聚到了一起, 且不同品種間差異度大。33個品種中有4個品種的相似系數小于 95% (圖 5中用紅色方框圈出),分別為德徽油 88、浙油雜 319、華油雜 701、浙油雜315, 這4個品種一致性低, 可判定為穩定性較差或疑似更換品種, 其余品種間相似系數均大于 95%,一致性高, 穩定性好。

圖4 2016–2017年度國家冬油菜區試品種聚類分析結果Fig. 4 Cluster analysis of varieties participated in the 2016–2017 national winter-type rapeseed variety trial編號對應的品種名稱見表1。Numbers for varieties correspond with those given in Table 1.

3 討論

SNP標記是最具發展潛力的建庫標記之一, 其通常為二等位變異位點, 在基因組中密度高且分布均勻[12], 易于篩選一套高質量的核心SNP位點組合,實現數據間整合比較[13]。本研究借助于 Illumina公司推出的高通量的SNP芯片分型平臺, 一次可檢測52 157個SNP標記位點, 不僅可快速、高通量地檢測油菜品種的遺傳多樣性, 而且具有良好的重現性[14]。

為滿足構建甘藍型油菜品種 DNA指紋圖譜的要求, 需從52 157個SNP標記位點中, 挑選一套高質量的核心SNP標記。結合國內外對于油菜60K芯片SNP標記的篩選要求[15-19], 本研究剔除AA或BB基因型頻率為0的SNP標記及最小基因型頻率小于0.05, SNP得率小于0.80的SNP標記; 保留缺失率小于 5%的 SNP標記; 選擇分型圖分型清晰且分型邊界明顯的SNP標記。最終篩選出5374個覆蓋油菜全基因組的SNP標記, 使用PowerMarker V3.25軟件計算出所選SNP標記的PIC均值為0.27, 變化范圍是0.09～0.41, PIC值大于0.25的占55.94%, 其中A基因組PIC均值為0.26, C基因組PIC均值為0.27,略高于 A基因組, 與 Delourme等[20]的研究結果一致。因此, 此套SNP標記具有很高的多態性和可信度, 可用于油菜品種的指紋圖譜構建與鑒定分析。

本研究隨機選取8個品種做2次重復點樣對照,得出Infinium芯片的技術誤差為0.36%, 與Illumina公司公布的 0.1%的技術誤差十分接近, 證明了本次芯片實驗用于基因分型的精準性。191份甘藍型油菜材料的 18 145個遺傳相似系數的變幅為 52.17%～99.98%, 平均遺傳相似系數為 76.20%, 相似系數值在90%～93%區間的有16個, 在93%～95%區間沒有,在 95%～100%區間的有 22個(其中 2個來自不同品種間, 20個來自同一品種的對照實驗)。參照國家有關標準, 本研究將遺傳相似系數 95%作為品種特異性及一致性鑒定的閾值。

聚類分析可見, 大部分品種的遺傳相似性差別明顯, 具有很高的區分度, 且相同品種都能聚到一處, 證明利用篩選的5374個SNP標記對油菜品種進行特異性、一致性分析是可行的, 可用于構建我國冬油菜參試品種 DNA指紋圖譜, 也表明 2016—2017年度我國冬油菜參試品種種質資源豐富、品種間遺傳差異度大, 年度間一致性高。

利用 SNP標記可以為甘藍型油菜品種構建DNA指紋圖譜, 從而定制品種的基因指紋, 使每個品種都有唯一的指紋信息, 可為種子監管部門打擊假劣種子、準確鑒定油菜新品種提供有效的技術手段, 進而可保護育種家的知識產權, 達到規范市場行為的目的[21]。

4 結論

本研究篩選了5374個可用于構建甘藍型油菜品種 DNA指紋圖譜的 SNP標記, 并用其構建了2016—2017年度的我國冬油菜品種的 DNA 指紋圖譜和進行了品種間特異性與品種年度間一致性分析，在后續的研究中我們將著重進行標準品種及SNP標記的篩選, 規范試驗操作程序、軟件分析流程、數據庫系統開發管理, 構建以SNP標記為基礎的甘藍型油菜品種DNA指紋數據庫[22-23]。