郭 睿，李 曼，趙世平，黃小鐘，金雪媛，楊 軍

(西安交通大學第二附屬醫院病理科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

準確的病理診斷是腫瘤治療、療效分析、預后檢測的前提和基礎,也是延長帶瘤生存時間、降低腫瘤死亡率、改善預后的根本。因此,尋找廣譜性好、敏感性和準確率高的腫瘤標志物顯得十分重要。胸腹水是進展期惡性腫瘤最為常見一種臨床表現,是腫瘤發生胸腔臟器或胸膜腔轉移導致的繼發改變。但是,由于進展期惡性腫瘤患者同時也會合并其他良性病變引起胸膜腔積液,比如,結核、肺心病、胸膜炎、肝硬化、低蛋白血癥、終末期腎病、惡病質等。因此,準確、快速地從胸腹水樣本中查找腫瘤細胞,確定胸腹水性質對于判斷惡性腫瘤的進展、評價療效、預測預后、指導制定治療方案具有不可替代的重要價值和意義。為此，許多學者嘗試選擇多種分子靶標和制片技術以期提高診斷的準確率[1-3]。

p16基因又叫多腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS),是一種調控細胞周期的抑癌基因,其編碼的p16INK4a蛋白定位于細胞核內,是細胞周期依賴性激酶抑制因子(inhibitors of cyclin-dependent kinase 4,Ink4)和重要的抑癌基因,在細胞周期調控和腫瘤發生中發揮重要調控作用。既往認為,當p16基因由于缺失、突變、甲基化造成p16INK4a蛋白異常表達時,導致細胞的無限增殖引發腫瘤[4-6]。本研究采用免疫組化方法檢測胸腹水細胞蠟塊中p16INK4a蛋白表達情況,分析其作為胸腹水惡性腫瘤相關分子靶標的敏感性(sensitivity,SEN)、特異性(specificity,SPE)、陽性預測值(positive predictive value,PPV)、陰性預測值(negative predictive value,NPV),并探討p16INK4a蛋白表達在良惡性胸腹水的早期診斷、鑒別診斷中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇2014-03～2015-03西安交通大學第二附屬醫院存檔的胸腹水細胞蠟塊標本77例,男性42例,女性35例,年齡范圍21-87歲,平均54歲。所有病例均經病理學及臨床確診。惡性腫瘤胸腹水樣本60例,其中包括肺癌30例,乳腺癌7例,原發性肝癌5例,卵巢癌2例,其他惡性腫瘤16例;良性病變胸腹水樣本17例,其中包括細菌性肺炎7例,結核性胸(腹)膜炎3例,冠心病2例,肝硬化5例。

1.2 試劑和儀器

Anti-p16INK4a(clone 6H12)鼠單克隆抗體購自中國福州邁新生物技術開發有限公司。DAB染色試劑盒,使用全自動免疫組化儀器Ventana Bench Mark XT(瑞士,羅氏)。

1.3 HE染色和免疫組化染色方法

所有標本均經離心沉渣包埋、4 μm厚切片、常規HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用Ventana Bench Mark XT全自動免疫組化染色儀完成。用已知陽性標本作對照,用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

p16INK4a免疫組化染色按照質/核型分子判讀標準進行判讀[7]:①0,無著色;②+,≤10%細胞呈現不同程度的細胞質著色;③++,10%-30%的細胞胞質呈現強的棕褐色著色,或≤70%細胞胞質呈現弱或中等強度質著色;④+++,>30%細胞胞質呈強的棕褐色著色,或>70%的胞質呈中等強度著色。評分為“0”者判讀為陰性(表達缺失),評分為“+”者判讀為弱陽性(正常表達),評分為“++”和“+++”者判讀為陽性(表達上調)。

1.5 統計學方法

應用SPSS 18.0統計軟件處理全部數據,各組間陽性率差異采用χ2檢驗。計算p16INK4a診斷惡性胸腹積液的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值。

2 結果

2.1 p16INK4a蛋白在胸腹水細胞蠟塊樣本中表達

免疫組化染色結果顯示p16INK4a蛋白的表達模式為質/核型,在不同類型的胸腹水細胞蠟塊樣本中表達強度不盡相同:p16INK4a蛋白在良性胸腹水細胞蠟塊樣本中呈陰性或弱陽性表達,在惡性胸腹水樣本中呈陰性和不同強度的陽性表達(見圖1)。

p16INK4a蛋白在77例良、惡性胸腹水細胞蠟塊樣本中呈陰性(0)、弱陽性(+)、陽性(++)和強陽性(+++)表達的樣本比例各不相同,按照組成比進行統計學分析發現p16INK4a蛋白表達良性、惡性胸腹水樣本之間存在統計學差異(χ2=11.142,P=0.025),而在肺癌樣本與其他樣本之間無統計學差異(χ2=1.717,P=0.424,見表1)。

按照p16INK4a表達強度,將陰性(0)和弱陽性(+)病例合并為陰性組(≤+),將陽性(++)和強陽性(+++)病例合并為陽性組(≥++)后,在60例惡性胸腹水細胞蠟塊樣本中,p16INK4a蛋白表達上調(≥++)高達83.33%,其中在肺癌樣本中86.66%,其他惡性腫瘤樣本中80.00%,而在良性病變組僅為26.66%。經統計分析發現p16INK4a蛋白在惡性和良性病變胸腹水細胞蠟塊樣本中的陽性表達存在顯著差異(χ2=9.737,P=0.008)。但在肺癌和其他惡性腫瘤中的表達并無統計學差異(χ2=0.483,P=0.731,見表2)。

2.2 p16INK4a的敏感性、特異性和陽性預測值、陰性預測值

按照p16INK4a表達強度將陰性(-)和弱陽性(+)病例合并為陰性組(≤+)、將陽性(++)和強陽性(+++)病例合并為陽性組(≥++)后,以活檢結果作為標準,p16INK4a蛋白作為肺癌性胸腹水樣本診斷指標的敏感性為76.47%，特異性為69.23%，陽性預測值為86.67%，陰性預測值為52.94%,作為其他惡性腫瘤胸腹水診斷指標的敏感性為75.00%，特異性為60.00%，陽性預測值為80.00%，陰性預測值為52.94%;將肺癌組與其他惡性腫瘤組樣本合并后,p16INK4a蛋白作為惡性胸腹水樣本診斷指標的總敏感性為75.76%、特異性為64.29%、陽性預測值為83.33%、陰性預測值為52.94%(見表3)。

A.肺腺癌胸水HE染色(×20);B.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈陽性表達(×40);C.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈強陽性表達(×40);D.卵巢癌腹水HE染色(×40);E.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈弱陽性表達(×40);F.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈強陽性表達(×40)圖1 p16INK4a蛋白在胸腹水細胞蠟塊樣本中的表達Figure 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

表1 p16INK4a蛋白在胸腹水細胞蠟塊樣本的表達 例(%)Table 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion 例(%)

a惡性腫瘤組與良性病變組比較;b肺癌組與其他惡性腫瘤組比較

表2 p16INK4a蛋白在胸腹水細胞蠟塊樣本中表達 例(%)Table 2 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion cases(%)

a惡性腫瘤組與良性病變組比較;b肺癌組與其他惡性腫瘤組比較

表3 p16INK4a蛋白表達在診斷良、惡性胸腹水細胞蠟塊樣本診斷中的價值Table 3 The diagnostic value of p16INK4a protein expression for benign and malignancy of paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

3 討論

p16INK4a基因是首個被發現的直接參與細胞周期調控的抑癌基因。在正常細胞周期中,p16INK4a蛋白對CDK4/6-cyclinD1/Rb-E2F環路起負向調控作用,通過與周期蛋白D競爭結合CDK4/6,引起Rb蛋白脫磷酸化而失活,阻斷細胞周期通過R點而停留在G1期,從而維持細胞周期、調控平衡,并在腫瘤細胞的細胞周期調控和增殖中發揮重要的抑制作用[8-11]。

作為一種抑癌基因,既往研究認為在腫瘤組織中p16INK4a基因突變、缺失、啟動子甲基化導致的p16INK4a的表達缺失或下調是其重要分子機制[12-15]。但近來研究發現,在相當多腫瘤中p16INK4a蛋白的表達呈顯著性上調狀態[16-19],更有學者研究報道,p16INK4a甲基化和表達可同時存在[20,21]。因此,對于p16INK4a蛋白表達水平的判讀并不能簡單解讀為陰性表達或陽性表達,p16INK4a蛋白的陰性表達和強陽性表達均是腫瘤細胞特征性的免疫表型,反映的是兩種不同的細胞周期調控機制:p16INK4a蛋白呈現全陰性表達,預示p16基因缺失或啟動子區的高甲基化是腫瘤細胞周期調控異常的重要機制;當p16INK4a蛋白呈現彌漫強陽性核/質型表達時,說明Rb基因突變、缺失、甲基化引起的Rb蛋白缺失、低表達或活性降低,或cyclinD1-CDK4/6過度活化引起的Rb高磷酸化是腫瘤細胞周期調控異常的重要機制。

現已證實高危型HPV陽性的宮頸癌和癌前病變中均發現p16INK4a基因過表達與腫瘤的性質和HPV感染密切相關,而且采用免疫組化檢測p16INK4a的表達已成為HPV相關宮頸高級別病變及宮頸癌等惡性腫瘤分子的診斷的特異性分子靶標而被CFDA批準用于臨床[22-24]。本課題組近年來研究發現[25,26],除了HPV相關腫瘤,p16INK4a在多種非HPV相關惡性腫瘤中可出現代償性高表達,而這種代償性高表達陽性率高達70%以上,其中在乳腺癌的研究中,已將p16INK4a代償性高表達作為特異性標志,并應用于乳腺癌的診斷和鑒別診斷[26]。

本實驗通過將77例胸腹水制作成細胞蠟塊,采用免疫組織化學檢測p16INK4a蛋白的表達,結果發現,p16INK4a蛋白在惡性腫瘤和良性病變胸腹水樣本中的陽性表達存在顯著差異(P<0.05),但在肺癌和其他惡性腫瘤的表達并無顯著差異。這說明p16INK4a代償性高表達是胸腔轉移性腫瘤細胞周期異常的重要模式,但與惡性腫瘤的來源和組織學類型無明顯相關性。

進一步分析發現,將胸腹水細胞蠟塊免疫組化染色結果與最終活檢結果相比,肺癌組敏感性為76.47%、特異性69.23%、陽性預測值86.67%、陰性預測值52.94%;其他惡性腫瘤組敏感性為75.00%、特異性60.00%、陽性預測值80.00%、陰性預測值52.94%;將兩組合并后其敏感性最終活檢結果相比為75.76%、特異性64.29%、陽性預測值83.33%、陰性預測值52.94%。由此可見,p16INK4a蛋白可作為廣譜腫瘤標志物,并適用于良惡性胸腹水的診斷和鑒別診斷。

尋找腫瘤特異性標志物一直是提高惡性腫瘤診斷準確率的重要途徑[27,28],尤其是對于胸腹水等體液樣本,由于受到背景細胞的影響,單純從細胞病理學水平,以形態學判讀并不能滿足臨床診斷的需要。而p16INK4a蛋白以其特有的代償性高表達模型和廣譜特征,為良惡性胸腹水樣本的診斷和鑒別診斷提供了簡單、實用的腫瘤特異性分子靶標,且具有較好的敏感性和陽性預測值,適用于良、惡性胸腹水等體液樣本的診斷和鑒別診斷。

綜上所述,p16INK4a蛋白的表達缺失和代償性高表達均是惡性胸腹水中腫瘤細胞的免疫表型特征,可以作為良惡性胸腹水等體液樣本診斷和鑒別診斷的分子靶標,且廣譜性好、敏感性和陽性預測值高,適合用于良惡性胸腹水的診斷和鑒別診斷,有助于提高惡性胸腹水的陽性檢出率。