凍融胚胎卵裂球完整性及繼續發育與臨床結局的相關性

王 晶,李愛莉,孫 超,丁 旭,黃艷紅

(空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科生殖中心,西安 710032)

隨著玻璃化冷凍技術的日益成熟,凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)已越來越廣泛應用于臨床。FET可保存新鮮移植后剩余胚胎,增加患者累計臨床妊娠率,減輕卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發病風險,減少多胎妊娠發生率[1-3],同時降低早產率,圍生期死亡率以及新生兒低體重兒出生率[4,5]。影響FET能否獲得妊娠的因素有很多,如患者年齡、內膜情況、胚胎情況等[6],但就胚胎而言包括冷凍前胚胎發育速度和形態學評價、復蘇后胚胎損傷程度以及卵裂球復蘇情況。目前關于FET的研究很大一部分集中在卵裂球損傷胚胎移植后的臨床結局,而對卵裂球損傷胚胎能否繼續發育及發育情況的不同對臨床結局的影響研究較少[7]。本研究旨在探討復蘇后胚胎卵裂球完整性及繼續發育與FET妊娠結局的關系,從而更好地為FET周期挑選較高植入潛能和發育潛能的胚胎提供參考,以提高凍融胚胎移植周期妊娠率。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選擇2015-10～2016-10在本中心進行FET的患者420對夫婦,新鮮周期形成的胚胎,經患者夫婦同意將其予以凍存。根據解凍后移植胚胎的卵裂球的完整程度分組:解凍后移植胚胎的卵裂球均完整,為完整組,共312例;解凍后移植胚胎至少有一個卵裂球損傷但損傷比例≤50%,為損傷組,共108例。根據解凍后體外培養18-24 h內胚胎恢復有絲分裂的情況分別將完整組和損傷組分為3個亞組:完整組A1和損傷組B1(所有胚胎均恢復有絲分裂的FET周期組),完整組A2和損傷組B2(部分胚胎恢復有絲分裂的FET周期組),完整組A3和損傷組B3(無胚胎恢復有絲分裂的FET周期組)。

1.2 試劑

胚胎冷凍液VitrificationVT101和胚胎解凍液VitrificationVT102(KITAZATO,日本加藤公司),胚胎培養液Global total(美國Global公司)。

1.3 胚胎冷凍選擇標準

根據形態學參數,將體外培養3 d(D3)卵裂期胚胎分為以下4級:Ⅰ級,卵裂球8-10個,卵裂球均勻、細胞質均一、無空泡,碎片≤5%;Ⅱ級,4≤卵裂球≤6個或卵裂球≥10個,卵裂球均勻或略不均勻,細胞質均一、無空泡,碎片占5%-15%;Ⅲ級,卵裂球≥4個,同時卵裂球明顯不均勻,細胞質中有少量空泡,碎片15%-30%;Ⅳ級,卵裂球≤4個,卵裂球明顯不均勻、細胞質不均一、或有大量空泡,碎片占30%-50%。其中Ⅰ級和Ⅱ級為優質胚胎;Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級為可移植/可凍融胚胎。

1.4 方法

1.4.1 胚胎冷凍 冷凍載體選用型號為Cryotop (KITAZATO,日本加藤公司)。室溫下,將2-3個胚胎置于平衡液(equilibration solution,ES)中5 min,平衡結束后將ES中的胚胎放置于玻璃化液(vitrification solution,VS)表面,輕輕來回吹吸數次,在45 s內將胚胎放到冷凍載體前段標記位置,確認胚胎在載體上后,迅速投入液氮中,并在液氮中完成裝桿過程。

1.4.2 胚胎復蘇 確認冷凍管及冷凍載體患者信息無誤后,將載體在液氮中取掉套管后拿出,迅速浸入37 ℃解凍液(thawing solution,TS)中,使胚胎滑落入TS中,1 min后,按照濃度梯度遞減的順序,依次將胚胎移入稀釋液(diluent solution,DS)中3 min,洗滌液1(washing solution,WS1)中5 min,洗滌液2(washing solution,WS2)中5 min,最后置于預先在37 ℃、含5%CO2的培養箱內平衡好的胚胎培養液中培養。

1.4.3 內膜準備及黃體支持 月經周期規律、排卵正常的患者采用自然周期法,即于月經第12天開始用陰道B超和空腹血液中LH及P激素水平監測評估卵泡發育及排卵,于排卵當天開始每日陰道填塞黃體酮軟膠囊(安琪坦,法國法杏大藥廠)600 mg。在排卵后第3天解凍胚胎,選擇1-3枚胚胎移植。排卵異常的患者采用激素替代法,即于月經第3天起以遞增法口服戊酸雌二醇片(補佳樂,德國拜耳公司),陰式B超監測子宮內膜,子宮內膜厚度達9-12 mm時,開始每日陰道填塞黃體酮軟膠囊600 mg。使用黃體酮軟膠囊后第3天解凍胚胎,選擇1-3枚胚胎移植。

1.4.4 胚胎移植 移植前囑咐患者多飲水,充盈膀胱,移植時患者仰臥于移植床上,常規清潔外陰及陰道,陰道窺器暴露宮頸去除宮頸黏液。在腹部超聲引導下,根據內膜形態及厚度,將載有1-3枚胚胎的移植管(wallace,英國)的內管頂端送至宮腔中或中下段,緩慢注入裝有胚胎的移植液至子宮腔,推注完畢停留約5-10 s,緩慢退出內管。移植管送實驗室檢查,在顯微鏡下觀察確定無胚胎遺留后,完成移植。術后患者平臥休息1 h左右。

1.4.5 妊娠判斷標準 胚胎移植后14 d,檢測血β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG),陽性者為生化妊娠,移植后4周超聲檢查,有孕囊及原始心管搏動即診斷為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數,種植率=孕囊數/移植胚胎數。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 卵裂球完整組與損傷組臨床結局的比較

兩組患者年齡、凍融胚胎移植日子宮內膜厚度、平均移植胚胎數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。兩組患者臨床妊娠率無統計學意義(P>0.05),而其胚胎種植率有顯著差異(P<0.05,見表1)。

表1 卵裂球完整組與損傷組臨床結局的比較Table 1 Comparison of the clinical outcomes between intact group and injury group

與完整組A比較,*P<0.05

2.2 卵裂球完整性及進一步恢復卵裂情況與臨床結局的關系

完整組A1、A2和A3亞組在患者年齡、內膜厚度、移植胚胎數方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。完整組A1比完整組A3有更高的臨床妊娠率和胚胎種植率,差異有統計學意義(P<0.05),而完整組A1與A2組,A2與A3組之間臨床妊娠率和胚胎種植率比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

損傷組B1、B2和B3在患者年齡、內膜厚度、移植胚胎數方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。損傷組B1與B3組在臨床妊娠率比較差異無統計學意義(P>0.05),但是損傷組B1相對B3組有更高的胚胎種植率,差異有統計學意義(P<0.05),而損傷組B1和B2組,損傷組B2和B3兩組之間臨床妊娠率和胚胎種植率比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

完整組A1與損傷組B1、完整組A2與損傷組B2、完整組A3與損傷組B3在患者年齡、內膜厚度、移植胚胎數方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。完整組A1、完整組A2與損傷組B1、損傷組B2臨床妊娠率比較差異無統計學意義(P>0.05),但是完整組A1、完整組A2相對損傷組B1、損傷組B2有更高的胚胎種植率,差異有統計學意義(P<0.05),而完整A3與損傷組B3兩組之間臨床妊娠率和胚胎種植率比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

表2 卵裂球完整性及進一步恢復卵裂情況與臨床結局的關系Table 2 Relationship between embryo blastomere integrity,situation of embryo recovery and clinical outcome

與完整組A1比較,*P<0.05;與完整組A2比較,#P<0.05;與損傷組B1比較,ΔP<0.05;完整組A1,損傷組B1為所有胚胎均恢復有絲分裂的FET周期組;完整組A2,損傷組B2為部分胚胎恢復有絲分裂的FET周期組;完整組A3,損傷組B3為無胚胎恢復有絲分裂的FET周期組

3 討論

FET技術是現代輔助生殖技術重要的衍生技術之一,隨著玻璃化冷凍技術的日益成熟,FET已越來越廣泛應用于臨床。影響FET能否獲得妊娠的因素有很多,如患者年齡、內膜情況、胚胎情況等,但就胚胎而言包括冷凍前胚胎發育速度和形態學評價、復蘇后胚胎損傷程度以及卵裂球復蘇情況。研究證實,凍融胚胎的完整性和發育潛能是影響冷凍周期妊娠率的重要因素[8,9]。胚胎卵裂球損傷在凍融過程中比較常見。胚胎卵裂球出現不同程度的損傷后,移植這些卵裂球受損胚胎是否影響妊娠和植入呢?這個問題一直是生殖界關注和爭論的焦點之一。有研究顯示移植1-2個卵裂球受損胚胎與完整存活胚胎具有相似的妊娠率[10]。而有研究則認為,受損胚胎降低妊娠率和胚胎植入能力,移植部分受損胚胎的種植率比完整存活胚胎低[11]。而胚胎的發育潛能通過過夜培養后是否能夠恢復有絲分裂繼續生長來評判。孫貽娟等[12]的研究表明胚胎在解凍后4 h有絲分裂即可恢復,凍融胚胎有絲分裂的恢復預示著胚胎有良好的發育潛能和更好的臨床結局。

本研究綜合考慮了凍融胚胎的完整性和發育潛能兩方面的因素,深入探討了這兩種因素對臨床結局的影響,結果顯示卵裂球完整的凍融胚胎,在患者年齡、內膜厚度、移植胚胎數等因素無統計學差異的前提下,全部胚胎恢復有絲分裂組與無胚胎恢復有絲分裂組相比,有著更高的臨床妊娠率和胚胎種植率,且存在統計學差異,而這兩組與部分恢復有絲分裂組胚胎相比較指標均無統計學差異。對于卵裂球損傷的凍融胚胎,在患者年齡、內膜厚度、移植胚胎數等因素無統計學差異的前提下,全部胚胎恢復有絲分裂組與無胚胎恢復有絲分裂組相比,有著更高的胚胎種植率,且存在統計學差異,而這兩組之間的臨床妊娠率并無統計學差異。與卵裂球完整組相同的是,部分生長的卵裂球損傷胚胎與全部生長和無生長組相比較兩組指標也均無統計學差異。這些結果也表明,無論是卵裂球完整胚胎還是部分卵裂球損傷的胚胎,如果在體外培養中能繼續發育,仍提示有較好的妊娠結局;但如果胚胎繼續培養中沒有進一步發育,多提示胚胎的發育潛力較低,臨床預后較差。

在有同樣繼續發育情況的前提下,移植卵裂球損傷胚胎組比移植完整存活胚胎組的胚胎種植率明顯降低,差異存在統計學意義(P<0.05),提示卵裂球受損影響胚胎的植入潛力,與種植率密切相關。部分卵裂球損傷的胚胎著床能力降低,可能原因是損傷后的卵裂球分解代謝產生某些毒性物質,可影響其他卵裂球的繼續卵裂、孵出乃至種植潛能[13]。

綜上所述,凍融胚胎解凍后可通過過夜培養,甄選有發育潛能的胚胎進行移植,以改善妊娠結局。而無論胚胎本身是否發生損傷,過夜培養后又全部未繼續發育的胚胎,應慎重考慮該周期是否進行移植。