郝嬋娟 陳臘梅 郭 俊 郭若蘭 唐浩勛 李 巍

Noonan綜合征(Noonan syndrome，NS)是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床表現為先天性心臟病、身材矮小、特殊面容、發育遲緩、凝血功能障礙、骨骼畸形等，累及多個系統器官[1-3]。在活產兒中的發病率約為1/2 500～1/1 000[3-4]。家族性復發符合常染色體顯性遺傳模式，但散發病例更為常見，約占60%[5]。目前認為，NS發病與絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路(RAS-mitogen-activated protein kinase，RAS-MAPK)的信號異常相關。隨著分子診斷技術的不斷發展和運用，目前已明確多個基因與NS及類NS樣疾病相關，包括PTPN11、SOS1、RAF1、BRAF、KRAS、NRAS、SHOC2、CBL、MAP2K1、SOS2、RIT1、RASA2和A2ML1[6-8]等。本研究對1例疑似NS患兒及其父母進行全外顯子測序，發現該患兒存在1個BRAF基因的新生雜合突變。通過回顧患兒的臨床表型、實驗室檢查，分析突變基因型與臨床表型相關性，將為NS患兒臨床診斷、治療和遺傳咨詢提供更好的依據。

資料與方法

1.病例選擇 患兒，身高75cm，體質量10kg，生長發育落后(1歲，可獨坐；3歲，可說單個詞語；4歲，可扶走，有眼神交流，對答反應略緩慢，無智力倒退史，否認驚厥史)，軀干與四肢皮膚無斑點角化過度，頭發偏少，略卷曲，但發質正常，無明顯脫落。特殊面容：前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、無外眼角下垂及眼球震顫、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋、小頜畸形、頸短(圖1)。胸廓未見畸形。心前區無異常隆起，心音有力，律齊，胸骨左緣第二肋間聞及3/6級收縮期雜音。掌跖皮膚大致正常。肌張力基本正常，肌力Ⅴ—級。患兒為第二胎第二產，足月順產，出生時體質量3.4kg。母孕期常規檢查，超聲心動圖提示：胎兒心胸比增大，心臟增大，室壁增厚，二尖瓣、三尖瓣、靜脈導管頻譜異常，動脈導管舒張期血流增快，卵圓孔偏大，偶發心動過緩。出生后3個月于我院行超聲心動圖檢查，確診為輕度肺動脈瓣狹窄、卵圓孔未閉。9月齡時查發育商低下。1歲6個月時于我院行超聲心動圖，示中度肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉(圖2)。2歲時于某醫院完成肺動脈瓣狹窄球囊擴張術。2歲時，腸系淋巴結彩色多普勒超聲檢查腹腔內未見明顯腫大淋巴結。3歲前患兒反復呼吸道感染。

2. 實驗室檢查 9個月齡時血尿代謝病篩查未見異常，2歲時于肺動脈瓣狹窄球囊擴張術前進行血常規、肝腎功能、出凝血時間、免疫球蛋白檢查，結果均正常。氨基酸、肉堿血代謝篩查未發現特異性脂肪酸代謝異常。血生化檢查示堿性磷酸酶(ALP)偏高(156U/L，正常范圍35～100U/L)，肌酐(CREA)偏低(18.3μmol/L，正常范圍45～84 μmol/L)。全血細胞分析：血小板(PLT)數量正常，血小板分布寬度(PDW)偏低(7.8%，正常范圍9.9%～16.1%)，大血小板比率(P-LCR)偏低(7.8%，正常范圍13%～43%)。

2017年8月患兒家屬來北京兒童醫院遺傳咨詢門診進行遺傳咨詢。父母非近親結婚，家族中無類似患兒。本研究得到北京市兒童醫院倫理委員會批準，并經患兒及其家屬知情同意，簽訂知情同意書。

圖1 患兒主要臨床特征 A～B：正面圖，C～D：側面圖

圖2 患兒超聲心動圖 圖示中度肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉。房間隔卵圓窩處回聲中斷約2.6mm。肺動脈瓣為三葉瓣，瓣膜回聲稍粗厚，活動尚可， 瓣環徑約11.6mm，瓣口徑約8.3mm

3．基因組DNA的提取：取患兒及其父母外周靜脈血2mL(EDTA抗凝)，用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。

4．全外顯子測序：將基因組DNA打斷成隨機片段，經純化后使用Agilent SureSelect Human All Exome V6試劑盒(加拿大Agilent Technologies公司)進行全基因組外顯子捕獲，捕獲后的片段經過富集度質控后進行測序文庫制備，利用Illumina Hiseq X Ten測序儀(美國Illumina公司)進行雙端高通量測序，讀長為150bp，測序得到的數據經過基本數據分析(Base calling、過濾接頭序列、去污染)，運用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件[9]比對到GRCh37/hg19參考基因組上，識別樣本的單核苷酸多態性(SNPs)和插入缺失突變(InDels)并對其所在基因進行注釋，同時進行測序深度、覆蓋度及均一性等有效數據統計。

5．生物信息學分析：利用dbSNP數據庫、千人基因組、ExAC數據庫分析變異頻率，濾掉次等位基因頻率>0.005的普遍變異。利用五種預測軟件SIFT(http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html)、Polyphen-2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org)、Mutation Assessor(http://mutationassessor.org/)和CADD(http://cadd.gs.washington.edu/)對變異位點進行有害性分析，以鑒定變異對蛋白質功能的潛在影響。同時篩查變異位點是否被三個疾病數據庫(ClinVar、OMIM、HGMD)收錄為有害變異。此外，利用UCSC(http://genome.ucsc.edu)進行BRAF新發突變位點同源序列保守性分析，利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/protein/P15056)進行BRAF新發突變位點結構域分析。利用美國醫學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)分級標準對變異進行分級[10]。

6．Sanger測序驗證：根據需要測序的DNA片段合成引物，對患兒及其父母DNA用PCR的方法進行擴增，用ABI 3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以Sanger測序法進行測序，測序結果與全外顯子測序后的結果進行比對。

結 果

圖3 患兒及其父母基因檢測結果 在患兒BRAF基因中找到新生雜合錯義突變c.770A>G(p.Q257R)(紅色箭頭)，其父母均無此變異(綠 色箭頭)

1. 基因檢測結果：通過生物信息學分析，在患兒BRAF基因中找到一個雜合錯義突變c.770A>G(p.Q257R)，導致該蛋白第257位的谷氨酰胺改變為精氨酸，其父母此位點為正常基因型，該變異為患兒“新發突變”。設計引物擴增后進行Sanger 測序，測序結果與全外顯子測序結果相同(圖3)。該患兒有一位7歲的哥哥, 生長發育無異常，未做基因檢測。BRAF突變可導致心面皮膚綜合征(cardio-facio-cutaneous，CFCS)和NS。c.770A>G(p.Q257R)在三個SNP數據庫(dbSNP，千人基因組和ExAC)中未發現變異頻率，dbSNP報告的SNP號為rs180177035(表1)。HGMD、ClinVar和OMIM三個疾病數據庫收錄該變異為致病變異。五種預測軟件SIFT、Mutation Taster、Polyphen-2、Mutation Assessor、CADD預測該變異對蛋白質功能是有害或可能有害的(表2)。BRAF新發突變位點位于甘油二酯和佛波酯結合結構域(圖4)，在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性(圖5)。根據ACMG分級標準，我們將BRAF c.770A>G分級為致病變異。

2. 患兒的臨床特征符合NS的診斷標準[11]，結合基因檢測結果，診斷為NS。

圖4 BRAF c.770A>G(p.Q257R)位于甘油二酯和佛波酯結合結構域

圖5 BRAF c.770A>G(p.Q257R)在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性

基因轉錄本cDNA蛋白雜合性ExAC千人基因組dbSNPBRAFNM_004333c.770A>Gp.Q257R雜合子--rs180177035

表2 患兒BRAF c.770A>G致病性預測

討 論

通過對患兒及父母進行全外顯子測序，我們發現患兒在BRAF基因存在一個新發錯義突變c.770A>G(p.Q257R)。BRAF含18個外顯子，位于染色體7q34，編碼參與MAPK/ERK信號傳導途徑的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAS的效應物和MAPK組件的上游組分，參與調節細胞的生長、分化、增殖、衰老和凋亡，在癌癥和發育綜合征中發揮重要作用[12-15]。

BRAF是CFCS的主要致病基因(約占50%～75%)，而在NS病例中極少見(<2%)[16]。與CFCS相關的BRAF突變大部分發生在外顯子6和外顯子12上。錯義突變c.770A>G(p.Q257R)是發生在外顯子6的最常見的突變(發生率為29%)[12]。BRAF c.770A>G位于甘油二酯和佛波酯結合結構域，多種預測軟件預測該變異對蛋白質功能是有害或可能有害，在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性。Tetsuya 等的研究表明c.770A>G(p.Q257R)突變顯著激活ELK依賴性轉錄，有助于BRAF的激活，刺激RAS-ERK途徑[14]，最終ERK信號分子進入細胞核內調節相關基因的轉錄并對刺激信號作出反應。根據ACMG分級標準，BRAF c.770A>G分級為致病變異。

大部分報道表明BRAF c.770A>G突變引起CFCS[12, 14, 17]，但是也有這個突變位點引起NS的報道[18]。CFCS與NS均為RAS-MAPK信號通路異常導致的疾病，故二者具有相似的臨床特征。

NS主要臨床特征包括身材矮小、特殊面容、先天性心臟病、發育遲緩、出血傾向、胸骨畸形、淋巴系統發育不良等，可累及多個系統器官。特殊面容包括前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋和增厚、頭發卷曲、后發際線低等，心臟病變最常見的是肺動脈狹窄(通常伴有異常增生的瓣膜，50%～60%)、肥厚型心肌病(20%)和繼發性房間隔缺損(6%～10%)[1- 2, 4, 19- 20]。

CFCS絕大多數病例由BRAF、MEK1、MEK2基因突變引起，常見的臨床表現包括特征性顱面畸形、先天性心臟病、皮膚異常、生長發育遲緩、胃腸功能紊亂、神經認知延遲和癲癇發作[21]。

CFCS與NS的區別在于存在外胚層發育異常和更嚴重的智力障礙[22]。與NS患者相比，CFCS患者的面部更寬、呈現大頭畸形、毛發生長緩慢，睫毛和眉毛稀疏或缺失、毛囊角化和掌跖角化過度、肌張力低下及更嚴重的發育遲緩和嬰兒期喂養問題[23-24]。為明確診斷，我們進一步比較了本例患兒的臨床表型與CFCS和NS的異同。本例患兒臨床表現為生長發育落后、特殊面容，超聲檢查示肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄，卵圓孔未閉。此患兒雖有生長發育落后，但程度較輕，與醫生有眼神交流，對答正確，僅略顯緩慢。神經系統檢查，肌張力基本正常，肌力稍低。本例患兒的臨床表型符合NS，BRAF c.770A>G為疾病的致病變異。中國人群中的相關文獻發現已報道4例基因診斷明確的NS患兒存在BRAF基因的新發雜合錯義突變[18]，其中有1例的突變位點與本例相同，臨床表型與本例患者基本相同，但出現喂養困難及胸部畸形，先天性心臟異常則表現為房間隔缺損。

NS的遺傳異質性強，同一基因突變可有不同的臨床表現，甚至同一基因同一位點突變，臨床亦可表現明顯差異，所以僅通過臨床表型很難進行臨床診斷，而應結合分子遺傳學分析，從基因水平幫助臨床進行精確診斷。傳統的Sanger測序法測序通量較低，難以滿足NS基因診斷需求，需要高通量的方法來進行致病基因的檢測。近年來，隨著分子診斷技術的發展和生物信息學分析手段的豐富，全外顯子測序，作為一種快速而經濟的技術，已廣泛應用于遺傳性疾病的診斷[25-28]，其不僅使患兒在短時間內得到確診，還為理解疾病發病機制提供線索，從而引導臨床醫生尋求更可靠的遺傳咨詢以及更有針對性的臨床干預和治療。

NS缺乏特異性治療方案，目前仍以對癥治療為主，建議多學科聯合隨訪。典型的面部特征會隨年齡的增長而逐漸改變。先天性心臟異常如肺動脈瓣狹窄，可根據狹窄程度，選擇定期隨訪、介入治療或外科手術。本例患兒則采用肺動脈瓣狹窄球囊擴張術進行治療。在2007年，美國食品藥品監督局推薦伴有身材矮小的NS患兒可給予重組人生長激素(rhGH)治療。目前，國內也推薦rhGH用于治療伴有身材矮小的NS患兒[29]。與此同時，預防干預亦不容忽視，產前基因診斷有助于預防患兒出生，也是目前主要的干預措施。基因診斷不僅可以評估患兒的預后，還可為相關家庭再次生育提供產前咨詢和產前診斷的依據，以期真正達到預防和降低NS發生率的目的。