王釗，張本尚，王貝貝，劉樹博，楊明成，鄒建*

(1.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046；2.河南省科學院同位素研究所有限責任公司，鄭州 450015)

視覺，往往是影響消費者購買食品的首要因素，色澤艷麗美觀的食品更易受到人們的青睞[1]，因此，食用色素被廣泛用于食品的感官改善和品質提升[2]。在各類色彩中，紅色具有增強食欲和刺激購買欲的特性[3]，深受人們的喜愛。當前食用紅色素主要可分為人工合成紅色素和天然紅色素兩大類[4]。其中，合成紅色素雖然色彩飽滿、性質穩定、廉價易得[5]；但同時也存在營養價值較低，增加身體臟器負擔[6]，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用，導致兒童智力發育遲緩，行為性情過激[7]等安全問題。因此，天然紅色素的開發成為食用紅色素的重要研究方向。

隨著人們對于天然紅色素研究的不斷深入，除著色外，天然紅色素的保健功能(抗菌消炎、降低血脂等)也受到了人們的重視[8,9]。例如，紅棗色素為類黃酮類色素，除著色外，還具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、預防心腦血管疾病、降三高等藥效作用，可應用于抗癌、抗氧化等保健產品[10]。

在研究過程中，山楂紅色素引起了人們的興趣。山楂在我國分布廣泛、產品豐富，河南省是山楂的主要產區之一。新鮮山楂又稱紅果，富含多種營養成分，是我國的傳統美食之一，可直接食用并有益于人體健康[11]。新鮮山楂經釀造后可獲得兼具鮮艷紅色外觀、酸甜口味、營養豐富等優點的山楂醋[12]，是時下廣受好評的美味保健類天然飲品。山楂干粉碎可入藥，具有助消化、降低血脂血壓、防止血管粥樣硬化、抗菌消炎、止痛止血等功效[13]。山楂紅色素提取自山楂，含有可溶性糖、酸類和黃酮類物質，屬于天然花青素類色素，具有防癌抗癌、保護大腦、保肝護腎等多重保健功效[14,15]。此外，研究表明山楂紅色素具有良好的抗氧化和著色能力，同時能夠從保鮮和美化兩方面提升產品品質，并常常用于食品的風味調和。例如，使用山楂紅色素代替胭脂紅素添加在健胃消食咀嚼片中，既可利用其酸度促進消化，又可以很好地改善消食咀嚼片的外觀顏色[16]。又如，富含山楂紅色素的玫瑰軟糖，色澤紅潤，味道醇美，還具有抗疲勞、抗氧化和降血脂等作用[17]。此外，富含山楂紅色素的菊花、洛神花復合果醬色澤紫紅艷麗，口感細膩，酸甜適中，又兼具保健功能。迄今為止，山楂紅色素已廣泛用于果汁、果醬、果醋飲品和糕點甜品等多種食品產品中，增色增味，提升品質。

鑒于山楂紅色素的優秀品質，本文擬通過有機溶劑提取法對山楂紅色素進行提取，并優化其工藝條件。在參考相關提取工藝方案后[18,19]，引入超聲波輔助提取手段，并通過正交實驗法對各單因素提取條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

新鮮山楂：購于鄭州市大學路丹尼斯超市；無水乙醇(分析純)：天津富宇精細化工有限公司。

1.2 實驗儀器

HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌浴 鄭州長城科工貿有限公司；Hei-VAP Precision HL型旋轉蒸發儀 德國海道夫(Heidolph)儀器公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司；FA3204B型電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FreeZone型真空冷凍干燥儀 美國LABCONCO儀器公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 山楂的預處理

由于鮮山楂富含多種營養成分和色素，直接于空氣中進行切片、粉碎等操作會發生氧化作用而影響其品質；并且鮮山楂水分較多，直接處理會導致有效成分的大量流失，對實驗結果造成不利影響，故而需對鮮山楂進行干燥處理。雖然烘干等高溫處理方式具有良好的干燥效果，但在加熱過程中將不可避免地對山楂紅色素及其他成分產生不利影響，因此，本文采取冷凍干燥法，根據文獻報道的方法對山楂進行處理[20]。將干燥好的山楂粉碎，過篩，密封，置于干燥器中備用。

1.3.2 最大吸收波長的確定

稱取1.0 g山楂粉末，加入50 mL濃度為95%的乙醇溶液浸泡20 min，超聲波處理40 min，在50 ℃條件下加熱回流50 min，過濾后定容稀釋，用95%乙醇溶液做參比溶液，利用紫外可見分光光度計全波段掃描，按照文獻報道[21]，在200～700 nm波長范圍內確定最大吸收波長值。

1.3.3 單因素實驗條件設計

分別設置乙醇濃度(50%、55%、60%、65%、70%)、料液比(1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85)、提取溫度(30，40，50，60 ℃)、超聲時間(20，30，40 min)、提取時間(30，40，50，60，70，80，90 min)5個單因素，在排除對提取效率影響最小的因素后，保持余下4個單因素條件中的3個因素不變，探究另一個因素變化對提取山楂紅色素的影響，在此基礎上進一步對單因素條件進行優化，直至達到最優水平。

1.3.4 正交實驗設計

通過對單因素實驗結果的分析，在其基礎上選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間、提取時間4個因素中的較優水平，選用L9(34)正交實驗水平表，設計正交實驗，進一步優化提取山楂紅色素的工藝條件。

1.3.5 平行重復驗證實驗

在正交實驗得出的最佳提取條件下重復三次提取，對正交實驗的結果進行驗證，分析驗證實驗的結果。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

色素溶液用95%乙醇稀釋后，在波長200～700 nm范圍內出現了最大吸收波長(見圖1)，其最大吸收波長峰值在291 nm處，因此后續單因素實驗的吸光度值測定波長均為291 nm。

圖1 山楂紅色素最大吸收波長的確定Fig.1 Determination of maximum absorption wavelength of hawthorn red pigment

2.2 單因素條件對提取效果的影響

2.2.1 乙醇濃度變化對提取效果的影響

稱取5份1.0 g的山楂粉末，分別量取不同濃度的乙醇溶液(50%、55%、60%、65%、70%)，保持料液比1∶60、超聲時間40 min、提取溫度50 ℃、提取時間50 min不變，過濾后定容，在291 nm波長下分別測定不同濃度乙醇提取液的吸光度值，結果見圖2中(a)。

(a)

由圖2中(a)可知，當乙醇濃度增大時，提取效率隨之增大，乙醇濃度為65%時為最大值；此后繼續增大乙醇濃度時溶液的吸光度值有所下降(70%)。因此以乙醇濃度65%為中心，對其兩側的乙醇濃度進行篩選，進行精確定位乙醇濃度的實驗，實驗結果見圖2中(b)，當乙醇濃度以63%-65%-67%的比例遞增時，測得的吸光度值依然以65%時最大，因此選擇65%為最佳乙醇濃度條件。

(b)

2.2.2 不同料液比對色素提取的影響

稱取5份1.0 g的甜椒粉，分別按照料液比1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85的比例準確量取65%的乙醇溶液，經超聲處理后(40 min)，在50 ℃油浴中恒溫提取50 min，過濾后定容，在波長291 nm處測其吸光度值，見圖3。

圖3 不同料液比對提取效果的影響Fig.3 The effect of different solid-liquid ratios on extraction effect

由圖3可知，當料液比增大時，提取效率隨之增大，料液比1∶80時為最大值；此后繼續增大料液比(1∶85)溶液的吸光度值有所下降，因此，從節約材料的角度考慮，以1∶80為最佳料液比條件。

2.2.3 不同超聲時間對色素提取的影響

分別稱取3份1.0 g的山楂粉，按照料液比1∶80加入濃度為65%的乙醇溶液，經超聲處理(20，30，40 min)后，在50 ℃油浴條件下恒溫提取50 min，過濾后定容，在波長291 nm處平行測量吸光度值，結果見圖4。

由圖4可知，提取效率隨超聲時間增長而提高，當超聲時間為30 min時，溶液的吸光度值最大，繼續延長超聲時間至40 min，吸光度值反而下降。這是因為適當的超聲波作用時間，可利用其空化作用和機械作用增大色素與提取劑接觸面積，提高色素溶解程度；過長的超聲作用，可能會對色素造成破壞，降低有效成分含量，不利于色素提取。故提取條件中最佳超聲波作用時間為30 min。

圖4 不同超聲波時間對提取效果的影響Fig.4 The effect of different ultrasonic time on extraction effect

2.2.4 不同提取時間對色素提取的影響

稱取7份1.0 g的山楂粉，按照乙醇濃度65%、料液比1∶80、超聲時間30 min、提取溫度50 ℃的提取條件分別提取不同時間，過濾后定容，在波長291 nm處測量吸光度值，結果見圖5。

圖5 不同提取時間對提取效果的影響Fig.5 The effect of different extraction time on extraction effect

由圖5可知，提取時間在30～70 min內吸光度值逐漸增大，在70 min時吸光度值達到最大；當提取時間分別延長至80 min和90 min時，吸光度值略有下降且趨于穩定，說明在此提取條件下色素已全部溶于提取劑。故山楂紅色素提取時間以70 min為佳。

2.2.5 不同提取溫度對色素提取的影響

分別準確稱取4份1.0 g的山楂粉，按照前面已經確定的乙醇濃度(65%)、料液比(1∶80)、超聲時間(30 min)、提取時間(70 min)，在不同的油浴溫度(30，40，50，60 ℃)下提取，過濾后定容，在波長291 nm處分別測量吸光度值，結果見圖6中(a)。

由圖6中(a)可知，提取效率隨提取溫度的上升而上升，在30～50 ℃范圍內，提取溫度越高，提取效果越好，50 ℃時吸光度值最大，60 ℃時吸光度值有所下降。因此，以50 ℃為中心對其兩側的溫度(45，55 ℃)進行篩選，實驗結果見圖6中(b)，與50 ℃時吸光度值相比，45 ℃條件下的吸光度值更大，因此45 ℃為最佳提取溫度。

(a)

(b)

2.3 正交實驗確定最優提取條件

通過對各個單因素實驗結果的分析，固定提取溫度為45 ℃不變，選取乙醇濃度(60%、65%、70%)、料液比(1∶75、1∶80、1∶85)、超聲時間(20，30，40 min)、提取時間(60，70，80 min)進行四因素三水平正交實驗，篩選最優提取方案，具體實驗方案見表1，實驗結果見表2。

表1 L9(34)正交實驗因素水平設計表Table 1 The factors and levels design table of L9 (34) orthogonal experiment

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results

由表2中極差R值可知，山楂紅色素提取條件中4個因素對提取效果存在不同程度的影響，各影響因素對提取效果的影響力為：A(乙醇濃度)>B(料液比)>D(提取時間)>C(超聲時間)，其中最重要的影響因素是乙醇濃度。由正交實驗結果可知，提取山楂紅色素的最優方案是A3B3C3D2，即乙醇濃度70%、料液比1∶85、超聲時間40 min、提取時間70 min。

2.4 最優工藝條件驗證實驗

由于最佳提取方案并未出現在正交實驗表中，為確保其真實性，在該提取工藝條件下進行了3 組重復驗證實驗，并取其平均值。由表3可知，驗證實驗結果具有代表性，表明該提取工藝條件是合理可行的，重現性好。

表3 重復實驗結果Table 4 Repeated results of orthogonal experiment

3 結論與建議

通過對山楂粉中山楂紅色素提取的單因素條件進行篩選，結果表明在單因素實驗中每個單因素最佳條件分別為：乙醇濃度65%、料液比1∶80、超聲時間30 min、提取時間70 min、提取溫度45 ℃。通過對單因素實驗分析，因溫度變化對提取效果影響微弱，固定提取溫度不變，其余4個單因素經正交實驗設計，最佳提取工藝方案是：提取溫度45 ℃、乙醇濃度70%、料液比1∶85、提取時間70 min、超聲時間40 min。通過3次平行重復驗證實驗，所得吸光度值重現性較好，說明此工藝條件對山楂紅色素的提取具有明顯優勢。

通過本文的研究，為高效提取山楂紅色素提供了思路，而豐富的山楂紅色素產品可以更好地滿足我國食品加工行業對其的需求，獲得更多兼具色、香、味和保健功效的食品和飲品，提升經濟和社會效益。