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(1.哈爾濱體育學院,哈爾濱 150008; 2.廣東省檢迅檢測科技有限公司,東莞 523843;3.深圳市匯知科技有限公司,深圳 518101; 4.深圳市通量檢測科技有限公司,深圳 518102)

漿果類水果品種繁多[1-3],如葡萄、草莓、番茄、獼猴桃和無花果等,深受廣大人民群眾的喜愛,是人類日常食用的水果大類;我國是漿果類水果種植大國,如我國葡萄種植面積現居世界第二位,種植品種約100種之多,漿果類水果在種植過程中,病蟲害是影響該產業的最主要的因素。據統計,危害葡萄的病蟲害有40多種[4-7],霜霉病、灰霉病等是影響其產量最主要的因素;酰胺類殺菌劑[8-10]是指化學結構中含有酰胺結構的一類化學殺菌劑,對防治漿果類水果中的霜霉病、灰霉病等有較好的效果。目前,酰胺類殺菌劑是近年來新品種開發最多的一類殺菌劑,市場份額逐年增加;酰胺類殺菌劑具有廣譜、低毒、易降解等特點,但誤食用到該類殺菌劑仍會對人類的身體造成亞急性中毒,輕者頭暈和心悸等,重者嘔吐、痙攣和四肢無力等,因此加強對漿果類水果中酰胺類殺菌劑殘留量的監測,具有十分重要的意義。

目前,漿果類水果中農藥殘留檢測前處理的主要方法有固相萃取法[11]、凝膠凈化色譜-濃縮法[12-13]和QuEChERS提取法[14-17]。國家標準GB 23200.8-2016《水果和蔬菜中500種農藥及相關化學品殘留量的測定》中氣相色譜-質譜法是較為權威的測定方法,其中前處理方法為氨基柱(NH2)固相萃取法。固相萃取法和凝膠凈化色譜-濃縮法,儀器自動化程度高,但處理過程冗長,處理過程中易造成待測物的損失,檢測準確度較低,且試劑的使用量較大,易對環境造成污染;QuECh ERS提取法是近年來發展起來的一種快速樣品前處理技術,處理過程簡單,效率高且檢測準確度高,溶劑使用量低,環境友好度高。本工作采用QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜法測定葡萄等漿果中7種酰胺類殺菌劑殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

2010 PLUS型氣相色譜儀;TQ-8040型三重四極桿質譜儀;AB-135型電子天平;N-EVAP型氮吹儀;H205R型高速冷凍離心機。

環氧七氯(內標液)、甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈、環酰菌胺、苯酰菌胺、環氟菌胺、噻呋酰胺標準溶液:100 mg·L-1。

內標溶液:移取100 mg·L-1環氧七氯標準溶液1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用正己烷稀釋、溶解,配制成質量濃度為10 mg·L-1的溶液,備用。

標準儲備溶液:分別移取質量濃度均為100 mg·L-1的甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈、環酰菌胺、苯酰菌胺、環氟菌胺、噻呋酰胺標準溶液各2.00 mL,置于20 mL容量瓶中,用正己烷溶解、定容,配制成質量濃度為10 mg·L-1的標準儲備溶液。使用時用正己烷稀釋至所需質量濃度。

乙腈、正己烷均為色譜純;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基硅烷(C18);無水硫酸鎂、乙酸均為分析純。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),柱溫320 ℃,進樣口溫度為250 ℃;不分流進樣;載氣為氦氣,純度大于99.999%,載氣流量為1.8 mL·min-1;進樣量為1.0μL。柱升溫程序:初始溫度60℃,保持2 min;以20 ℃·min-1速率升溫至180 ℃,保持3 min;再以15 ℃·min-1速率升溫至280 ℃,保持10 min。

2)質譜條件 電子轟擊(EI)離子源;多反應監測(MRM)模式;轟擊能量為70 e V;離子源溫度為260 ℃;接口溫度為250 ℃;碰撞氣為氬氣(純度大于99.999%);溶劑延遲時間為3.0 min;其余質譜參數見表1。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

將新鮮采摘的葡萄樣品用粉碎機粉碎、充分攪勻,制成勻漿。稱取已均質的葡萄樣品5.0 g,放入25 mL離心管中,加入1%(體積分數,下同)乙酸-乙腈溶液20 mL,無水硫酸鎂5 g,振搖10 min,以6 000 r·min-1轉速離心5 min。將離心后的有機層溶液轉移至預先加入無水硫酸鎂1.0 g、PSA 500 mg和C18500 mg,GCB 500 mg的25 mL離心管中,劇烈振搖3 min,使樣品得以充分凈化。再以6 000 r·min-1的轉速離心5 min。取上清液5.0 mL至刻度試管中,于60 ℃水浴式氮吹儀中用氮氣吹至近干,殘渣用正己烷定容至1.0 mL。經0.2μm有機濾膜過濾后轉移至小進樣瓶中,加入10 mg·L-1的環氧七氯溶液20μL,混勻,按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

7種殺菌劑混合標準溶液的標準譜圖見圖1。

圖1 7種殺菌劑混合標準溶液的標準譜圖Fig.1 Standard spectrum of mixed standard solution of seven fungicides

2.2 前處理方法的選擇

試驗分別考察了氨基固相萃取柱和Qu ECh ERS前處理方式對樣品凈化和回收效果的影響,在空白葡萄樣品中加入質量濃度為0.1 mg·L-1的7種酰胺類殺菌劑混合標準溶液,按照儀器工作條件進行測定,結果見表2。

由表2可知:氨基固相萃取柱凈化效果較好,但是樣品的回收率最低;QuEChERS前處理方式所得的測定結果中7種酰胺類殺菌劑的回收率均高于固相萃取柱萃取結果。原因可能是氨基固相萃取柱對酰胺類殺菌劑的吸附性較強,Qu ECh ERS所用的凈化劑PSB、GCB和C18為非極性,對酰胺類殺菌劑無吸附作用。考慮到Qu ECh ERS處理過程中所用溶劑較少、且前處理快速,試驗選擇QuEChERS作為前處理方式。

表2 QuEChERS方法與國家標準前處理方法提取結果比較Tab.2 Comparison of extraction results of pre-treatment method of QuEChERSand national standard%

2.3 萃取溶劑的選擇

試驗考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等4種不同萃取溶劑的萃取效果。在加入最終質量濃度為0.1 mg·L-1的混合標準溶液時,其他條件保持不變,按照試驗條件測定了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等萃取溶劑所得到的回收率,測定結果見表3。

表3 不同溶劑萃取效果的比較Tab.3 Comparison of extraction efficiency of different solvents%

由表3可知:乙酸乙酯萃取時,葡萄等漿果中的糖分、蠟質也被共提出來,質譜離子肼及氣相色譜進樣口容易污染導致靈敏度降低;丙酮作為萃取溶劑時,由于丙酮的極性較弱,對極性較強的農藥如環酰菌胺、環氟菌胺等萃取效果不理想,回收率偏低。乙腈是萃取中應用最多的一種溶劑,對大多數農藥溶解性好,共提物少,可以有效降低基線噪聲,提高檢測靈敏度。考慮到酸堿敏感性農藥的穩定性,試驗選擇了1%乙酸-乙腈溶液為萃取溶劑。

2.4 基質效應的影響

基質效應是待測樣品中除目標物以外的其他成分對測定結果的影響。一般來說,不同的樣品基質對測定值的影響亦不同。研究表明:在氣相色譜-質譜法中,大多數樣品對待測物存在基質增強效應。當前農殘處理常用的消除基質效應的方法為基質匹配標準法,該方法以模擬樣品環境的方式(如稱取待測樣品,在萃取、凈化、濃縮后的提取物中,用標準曲線溶液系列配制不同濃度點的基質匹配溶液)來補償樣品中農藥的吸附或降解。試驗采用加入內標物環氧七氯的方式來消除色譜系統進樣帶來的誤差及前處理導致的損失。基質標準液內標法為本方法定量檢測的依據。本方法仍以加入質量濃度為0.1 mg·L-1的混合標準溶液來考察標準溶液與內標基質匹配標準溶液校正所得到的回收率,結果見表4。

表4 純標準溶液與基質匹配標準溶液比較Tab.4 Comparisons of pure standard solution and matrix matching standard solution%

由表4可知:加入內標物環氧七氯后,7種殺菌劑殘留量的回收率為89.2%～93.6%,相比較未加內標物回收率為82.6%～89.5%,說明采用環氧七氯作為內標物的方法具有更好的準確度。

2.5 質譜條件的優化

采用Q3SCAN全掃描模式對10 mg·L-1的混合標準溶液進行全掃描,得到7種酰胺類殺菌劑相對應的前體離子及保留時間;運行不同碰撞能量產物離子掃描方法,自動比較數據文件,選擇合適的產物離子和合適的碰撞能量,然后在該電壓下對產物離子進行掃描,得到各自對應的碎片離子;選擇響應較高的離子對作為定量離子對,另選擇兩組離子對作為定性離子對。保留時間、特征離子對保證定性結果的準確性;排除了假陽性樣品。使用wizard功能重新優化參比離子的比率,各農藥殘留的靈敏度均達到最佳狀態,檢測結果更加準確、可靠,最終生成MRM檢測方法。

2.6 標準曲線與檢出限

按試驗方法對0.04,0.1,0.4,1.0,2.0,4.0 mg·L-1的7種酰胺類殺菌劑混合標準溶液系列進行測定,并繪制標準曲線。結果表明:7種酰胺類殺菌劑的線性范圍均為0.04～4.0 mg·L-1,其線性回歸方程、相關系數見表5。

以空白葡萄樣品的低濃度水平(0.02 mg·kg-1)加標回收的響應為基礎,以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結果見表5。

表5 線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.5 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度與回收試驗

按照試驗方法對空白葡萄樣品進行加標回收試驗,加標量為0.05,0.1,1.0 mg·L-1,每個加標樣品平行進樣6次,考察6次測定結果的相對標準偏差(RSD),結果見表6。

由表6可知:3個不同水平的加標回收率為86.2%～100%,RSD為1.6%～4.1%,符合方法中精密度要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對葡萄、藍莓、獼猴桃等3種漿果類水果中7種酰胺類殺菌劑進行測定。結果表明:葡萄、藍莓與獼猴桃中分別檢出甲霜靈為0.011 mg·kg-1、環酰菌胺為0.012 mg·kg-1、環酰菌胺為0.008 mg·kg-1。

本工作采用QuEChERS前處理方法結合氣相色譜-串聯質譜法建立了葡萄等漿果中酰胺類殺菌劑殘留量的測定方法。對前處理方法、萃取溶劑及質譜參數等進行了討論;考察了方法的線性、檢出限及精密度。對葡萄、藍莓和獼猴桃等漿果類樣品進行了測定。該方法縮短了前處理時間,減少了萃取溶劑的使用量,運用三重四極桿質譜分析,避免了假陽性樣品的存在。

表6 精密度與回收試驗結果(n＝6)Tab.6 Results of tests for precision and recovery(n＝6)