γ射線對Beagle犬腸道組織及糞便菌群的影響

許文黎,李曙芳,王新鋼,王遠飛,王永麗,胡波,李建國

(中國輻射防護研究院GLP中心；山西 太原，030006)

電離輻射在核醫學、食品輻照滅菌等方面具有廣泛應用，由此產生的電離輻射損傷逐漸成為一項重大的公共衛生問題。電離輻射損傷涉及造血、免疫、胃腸道、皮膚、晶體和中樞神經系統等各個方面，其中腸道組織自我更新較快，對電離輻射十分敏感，是電離輻射損傷的重要靶組織。本研究采用16srDNA技術，分析60Co γ射線不同劑量全身照射對Beagle犬的腸道組織及糞便菌群的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康Beagle 犬，體重7.5～8.0 kg，6～9月齡，南京柴門生物科技有限公司[許可證號：SCXK(蘇)2016—0007]。動物購回后，飼養于中國輻射防護研究院GLP中心[許可證號：SYXX(晉)2018—0005]。

1.2 動物分組與照射

鈷源，中國輻射防護研究院，鈷源標定證書編號：Dyjl2013-3512，標定單位中國計量科學研究院，標定時間2013年10月。

按體重將Beagle犬隨機分為空白對照組(不予照射)，2 Gy、3 Gy和 4 Gy 照射組，每組4只。60Co γ射線單次全身照射，劑量率50 cGy/min，源距為2.49 m。

1.3 觀察指標

1.3.1一般體征

每天觀察記錄動物的臨床表現，主要包括精神狀態、食欲、糞便、嘔吐情況等，記錄各組動物的存活時間，每周測量體溫、體重。

1.3.2腸道病理

動物處死后，取部分腸道組織，經10%福爾馬林固定、脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后，光學顯微鏡下觀察腸道的病理學改變。

1.3.316srDNA測序與生物學分析

在照射后第14天取動物新鮮糞便凍存于2 mL無菌凍存管中，置于-80 ℃保存；將所取糞便標本送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行16srDNA測序。

基于Silva132數據庫，將序列聚類成為OUTs，使用R軟件(Version2.15.3)、Qiime軟件(Version9.1)和LEFSe軟件進行α多樣性分析、β多樣性分析、門和屬水平的物種相對豐度及LEFSe分析。α多樣性分析采用Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數，其中Chao1指數和ACE反映物種的豐富度，Shannon指數和Simpson指數反映物種的多樣性和均勻性，Shannon指數越大、Simpson 指數越小，說明樣本中的物種多樣性越大；β多樣性分析采用主坐標分析，如果樣本距離越接近表示物種組成結構越相似。

1.4 統計學處理

使用Qiime軟件計算chao1、shannon、simpson、ACE指數，使用R軟件采用進行α多樣性組間差異分析，其中只有2個分組時進行t檢驗和wilcox秩和檢驗，分組大于2時進行wilcox秩和檢驗和Tukey檢驗。p<0.05為差異有統計學意義。

LEFSe分析使用LEFSe軟件，默認設置LDA Score的篩選值為4。

2 結果

2.1 一般癥狀

2 Gy照射組：所有動物在照射后均未見明顯異常。

3 Gy照射組：在照射后15天發現1只動物出現精神萎靡、食欲減退的現象，持續2天后精神狀態恢復，但仍見便血；照射后20天發現第2只動物出現輕微的食欲減退現象。

4 Gy 照射組：照射后20 h 有1只的盤內有粘稠狀嘔吐物，1只出現惡心反胃的表現；照射后7 d發現1 只動物出現稀便現象；照射后10 d和11 d 所有動物均出現流涎現象和胃腸道癥狀，主要表現為食欲減退；死亡動物在死亡前1 天均出現柏油便。于照射后 15、18、28 天各死亡1只，生存時間為 18.5 天。

體重：照射前各組動物體重均衡，照后各時間點各組動物體重差異不顯著。

體溫：照后第14 d，4 Gy照射組動物的體溫與對照組相比有所升高，與照射前相比亦有所升高，且差異顯著。

2.2 腸道組織病理

2 Gy 照射組：腸粘膜上皮細胞出現少量變性。

3 Gy 照射組：腸粘膜上皮細胞數量有所減少，出現變性細胞。

4 Gy 照射組：腸粘膜上皮細胞數量明顯減少，出現變性細胞，細胞大小不均一，隨照射劑量的增加，癥狀逐漸嚴重。3只死亡動物解剖可見腸系膜、直腸局部出血等癥狀。

2.3 OTU聚類與統計

對Beagle犬糞便樣品進行測序，以97%的一致性將序列聚類成OTUs，共得到592個OTUs，將OTUs序列與Silva132數據庫進行物種注釋，共587(99.16%)個OTU注釋到門水平，576(97.3%)個OTU注釋到綱水平，568(95.95%)個OTU注釋到目水平，547(92.40%)個OTU注釋到科水平，418(70.61%)個OUT注釋到屬水平，140(23.65%)個注釋到種水平。由圖1Rank-Abundance曲線可見，隨著OUT的遞增，曲線趨于平坦，表明測序深度已經基本覆蓋樣品中所有的物種。

圖1 等級聚類曲線

2.4 菌群多樣性分析

Beagle犬糞便腸道菌群α多樣性分析指數列于表1。由表1可見，4 Gy照射組的Shannon指數顯著低于空白對照組，Simpson指數顯著高于空白對照組；結果說明照射后Beagle犬的腸道菌群α多樣性呈下降趨勢，物種的豐富度無明顯變化。

表1 Beagle犬糞便腸道菌群α多樣性分析指數

圖2為β多樣性分析結果。由圖2可見，空白對照組的組內樣本與照射組的組內樣本距離較遠，說明空白對照組與照射組之間的β多樣性存在差異。

圖2 Beagle犬糞便腸道菌群β多樣性分析結果

2.5 糞便菌群門水平構成分析

空白對照組：糞便菌群主要有厚壁菌門和放線菌門組成，相對豐度的平均值分別為 93.2%和 4.3%。

2 Gy 照射組：糞便菌群主要有厚壁菌門和變形菌門組成，相對豐度的平均值分別為 94.2%和 4.1%，放線菌門下降到 0.7%。

3 Gy 照射組：糞便菌群主要有厚壁菌門、變形菌門和放線菌門組成，相對豐度的平均值分別為 83.6%、13.1%和 2.4%。

4 Gy 照射組：糞便菌群主要有厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門組成，相對豐度的平均值分別為 92.8%、3.4%、1.3%和 2.1%。

分析結果表明，照射后厚壁菌門和放線菌門均減少，變形菌門增加。

2.6 糞便菌群門水平構成分析

空白對照組：糞便菌群均主要有乳桿菌屬、艱難梭菌屬、蘇黎世桿菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬組成，相對豐度的平均值分別為36.0%、7.0%、18.6%、5.3%和 12.5%。

2 Gy 照射組：糞便菌群均主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、艱難梭菌屬、蘇黎世桿菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬組成，相對豐度的平均值分別為 47.3%、16.2%、11.8%、2.2%、3.2%和 0.7%。

3 Gy 照射組：糞便菌群均主要有乳桿菌屬、艱難梭菌屬、蘇黎世桿菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬組成，相對豐度的平均值分別為 50.3%、9.7%、2.3%、3.7%和 1.0%。

4 Gy 照射組：糞便菌群均主要有乳桿菌屬、艱難梭菌屬、蘇黎世桿菌屬和霍爾德曼氏菌屬組成，相對豐度的平均值分別為53.0%、7.3%和 6.3%。

分析結果表明，照射后艱難梭菌屬增多，蘇黎世桿菌屬、布勞特氏菌屬和霍爾德曼氏菌屬減少。

2.7 LDA effect size(LEFSe)分析

通過LEFse 分析，能夠展示空白對照組與 2 Gy、3 Gy、4 Gy 劑量照射組具有統計學意義的標志性菌群，找出照射不同劑量是發生改變的菌群。空白對照組以厚壁菌門、八疊球菌、艱難梭菌屬為優勢菌；2 Gy照射組以變形菌綱、變形菌門、鏈球菌目、鏈球菌科為優勢菌；4 Gy照射組以加氏乳桿菌、丹毒絲菌綱、丹毒絲菌目、丹毒絲菌科、羅伊氏乳桿菌、變形菌綱、變形菌門、桿菌門為優勢菌。

3 討論

腸道組織病理學檢查發現照射后腸道上皮細胞出現凋亡，細胞排列紊亂，出現水腫等現象，且隨著照射劑量的增加，癥狀逐漸嚴重，這可能與照射后14 d導致照射組Beagle 犬逐步出現食欲減退、嘔吐、稀便等現象有關。

腸道菌群作為寄居在生物腸道內的微生物群落，對生物的生長、發育、營養代謝、免疫穩態等起到重要作用[1-2]。腸道菌群通過在腸道內形成動態平衡的生態系統來維持屏障的穩態、調控機體的代謝[3]。小腸上皮細胞由于對電離輻射的高度敏感性，可誘導小腸隱窩細胞凋亡，破壞腸道屏障及菌群的組成[4]，導致致病菌激活腸道免疫系統從而引發腸道炎癥[5-6]，影響先天與后天的免疫系統[7-8]，這是腫瘤患者在接受放射治療過程中主要的損傷點，特別是胃腸道傷害，成為亟待解決的問題[9-10]。

研究發現，照射能夠導致Beagle犬的腸道菌群的α多樣性下降，這種改變不利于Beagle犬腸道菌群的生態平衡維持，可能直接或間接導致或加重腸道的放射性損傷。腸道菌群結構的改變，并且降低腸道菌群的多樣性，改變腸道菌群的結構，這與文獻報道的腸道微生物群變化的結果相吻合[11-13]。

變形菌門中包含眾多致病菌，在正常健康動物體內的含量較低[14-15]。但是，對本實驗的結果分析發現，照射后Beagle 犬分辨的變形菌門是空白對照組的3.4～13.1 倍，呈顯著增加趨勢；另外，分類下的大腸桿菌等有明顯增加。這些細菌多為革蘭氏陰性菌，能夠產生脂多糖。而脂多糖是內毒素和重要群特異性抗原，當細菌死亡是它能夠通過溶解、破壞細胞等發揮其毒性作用。艱難梭菌屬于格蘭氏陽性菌，可產生腸毒素和細胞毒素，使腸壁發生炎癥反應，損傷腸壁細胞，使腸壁通透性增加，從而導致腸壁壞死或假膜形成。因此，這些細菌在照射后的Beagle 犬腸道內進行過度增殖，可能造成腸粘膜炎癥加重，導致腸粘膜上皮細胞水腫、凋亡，造成腸粘膜破壞。臨床研究結果顯示，放射性腸炎患者的腸道菌群相比較無放射性腸炎的患者均有更高比例的紊亂，提示照射所引起的腸道反應與炎癥性腸病之間可能存在一定的相似性，具有相同的臨床癥狀，主要表現為腹瀉、腸道出血、吸收不良等，發病機制相似。腸道內的細菌代謝物或細菌本身通過免疫應答系統能夠激活T淋巴細胞，使其遷移至腸粘膜，或通過腸粘膜屏障進入體循環，從而引起一系列的免疫反應[16]。腸粘膜作為腸道的屏障系統，能夠維持腸道和機體的炎癥因子水平、細菌水平等。當腸粘膜發生破壞，穩態失衡，腸道內微生物菌群結構的變化和位移，可能會導致腸粘膜自身修復受阻，從而導致照射后出現腸道相關疾病。糞球菌和霍爾德曼氏菌屬的比例增加，可能是由于腸道損傷后機體自身的應激反應導致的。

4 小結

60Co γ射線全身照射Beagle犬，可導致Beagle犬腸道菌群的多樣性下降，造成致病菌的過度繁殖，雖然未成為腸道糞便中的優勢菌群，但相對比例增加，可能導致或加重照射后的腸道損傷。