成熟過(guò)程對(duì)紅曲霉干酪中生物胺的影響及其安全性評(píng)估

劉 景，劉振民*

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

生物胺是一類具有一定生物活性的低分子質(zhì)量含氮化合物的總稱，但人體攝入過(guò)量時(shí)則會(huì)產(chǎn)生頭痛、惡心、血壓波動(dòng)、呼吸困難等多種過(guò)敏性反應(yīng)。天然干酪中的生物胺主要由蛋白質(zhì)水解生成的游離氨基酸為底物、經(jīng)特定的酶脫羧產(chǎn)生[1]。生物胺普遍存在于多種食品中，如水產(chǎn)品、發(fā)酵酒、乳制品、肉類、蔬果等。乳制品中以干酪中生物胺最為典型。干酪中常見(jiàn)生物胺有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺8 種[2]。就組胺來(lái)說(shuō)，干酪中的含量?jī)H次于以魚(yú)類為代表的水產(chǎn)品[3]。因此，食品中天然產(chǎn)生的生物胺是食品安全關(guān)注重點(diǎn)之一。

目前，國(guó)際上對(duì)食品中的生物胺尚無(wú)統(tǒng)一限量標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)分別依據(jù)本國(guó)的法律法規(guī)制定標(biāo)準(zhǔn)。例如，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局將金槍魚(yú)等魚(yú)類中組胺的安全閾值設(shè)定為50 mg/kg，而酪胺和苯乙胺的安全閾值則分別為100～800 mg/kg和30 mg/kg[4]。印度規(guī)定生鮮和即食魚(yú)產(chǎn)品中組胺可接受限量為100 mg/kg，最大殘留量為200 mg/kg；而干制和發(fā)酵魚(yú)制品中上述限量值分別為200 mg/kg和400 mg/kg[5]。我國(guó)則在地方標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵肉制品中組胺含量不高于100 mg/kg[6]。

霉菌成熟干酪是一類以霉菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)的干酪，目前使用較多的霉菌發(fā)酵劑主要為卡地干酪青霉（Penicillium camemberti）、婁地青霉（Penicillium roqueforti）和白地霉（Geotrichum candidum），常見(jiàn)的霉菌干酪主要有藍(lán)紋干酪、卡門(mén)貝爾干酪和布里干酪等[7]。紅曲霉是中國(guó)傳統(tǒng)食物紅腐乳、紅曲米、紅曲酒等的主要霉菌發(fā)酵原料。紅曲霉作為干酪霉菌發(fā)酵劑不僅風(fēng)味、色澤易于被大多數(shù)國(guó)人接受，是霉菌干酪進(jìn)入大眾消費(fèi)領(lǐng)域的良好媒介，而且紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物被證實(shí)含有多種有益人體的活性物質(zhì)，如洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角固醇等，具有良好的營(yíng)養(yǎng)附加值。因此，近年來(lái)許多研究嘗試使用紅曲霉制作霉菌干酪[8-9]。但這些研究集中于將紅曲霉應(yīng)用于干酪的工藝和制作方法以及紅曲霉對(duì)干酪質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味產(chǎn)生的影響，對(duì)食品安全，尤其是紅曲霉干酪中生物胺的影響研究還很少。

本研究以生乳為主要原料，在霉菌干酪加工工藝的基礎(chǔ)上，使用紅曲霉作為霉菌發(fā)酵劑，制作紅曲霉干酪，研究紅曲霉干酪成熟過(guò)程中，不同的成熟條件對(duì)產(chǎn)生的生物胺種類及含量的影響，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展對(duì)紅曲霉干酪中生物胺攝入的初步安全評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生乳取自光明金山牧場(chǎng)。

乳酸菌發(fā)酵劑YO-MIX 900 科漢森（中國(guó)）有限公司；凝乳酶Marzyme 150MG 丹尼斯克（中國(guó)）有限公司；紅曲霉菌種（編號(hào)GM1809，來(lái)源于腐乳）為自行保藏菌株；組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；丹磺酰氯、碳酸鈉、碳酸氫鈉、甲醇、丙酮、正庚烷（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

精密天平 德國(guó)Santorius公司；1260高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國(guó)Agilent公司；干酪槽、模具等為自制。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉干酪加工工藝

生牛乳→標(biāo)準(zhǔn)化（蛋白質(zhì)含量3.1 g/100 mL）→巴氏殺菌（72 ℃、20 s）→冷卻（37 ℃）→接種乳酸菌發(fā)酵劑（1 g/100 L）→添加霉菌發(fā)酵液（體積比3%）→發(fā)酵（34 ℃、1.5 h）→加凝乳酶（40 IMCU/L）→切割→攪拌→入模排乳清→18 h后脫模→鹽浸（17 g/100 mL NaCl溶液，2 h）→成熟（10～20 ℃、25 d，相對(duì)濕度95%）→包裝→4 ℃存放

其中，成熟過(guò)程需要注意環(huán)境清潔，前72 h內(nèi)每隔24 h翻轉(zhuǎn)通風(fēng)，后期2～3 d翻轉(zhuǎn)1 次。在10、14、20 ℃ 3 個(gè)不同溫度成熟條件下分別檢測(cè)紅曲霉干酪中的生物胺含量，測(cè)定時(shí)間節(jié)點(diǎn)為0、3、7、14、21、25 d。

1.3.2 紅曲霉干酪中生物胺的測(cè)定

預(yù)處理及衍生化：取5 g紅曲霉干酪樣品（稱質(zhì)量前整塊攪碎并混合均勻），加入15 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液混勻，振蕩30 min后2 000×g離心10min，取上清液；按以上步驟使用高氯酸提取樣品3 次，合并上清液并過(guò)濾至容量瓶；用0.6 mol/L高氯酸溶液將濾液定容至50 mL，搖勻取0.5 mL樣液，加入1.5 mL碳酸鹽緩沖液（NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·2H2O，pH 10.0）和2 mL 7.5 g/L丹磺酰氯溶液（溶劑為丙酮），60 ℃反應(yīng)45 min后，40 ℃氮吹除去丙酮溶劑，加入3 mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL甲醇完全溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

高效液相色譜測(cè)定：參照劉景等[10]的方法，使用高效液相C18反相色譜分離衍生化樣品，衍生化試劑為丹磺酰氯，計(jì)算生物胺含量。

1.3.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全評(píng)估

本研究采用非參數(shù)概率評(píng)估模型（式（1））評(píng)估紅曲霉干酪中生物胺的風(fēng)險(xiǎn)[11]。

式中：y為紅曲霉干酪中生物胺暴露量/（μg/（kg·d））；p為生物胺的種類數(shù)；x為膳食調(diào)查中干酪的消費(fèi)量/（g/d）；c為紅曲霉干酪中生物胺的檢測(cè)值/（mg/kg）；m為人群體質(zhì)量/kg。其中，膳食調(diào)查干酪消費(fèi)量數(shù)據(jù)來(lái)自乳制品消費(fèi)調(diào)查資料[12-14]，人群體質(zhì)量數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康調(diào)查系列報(bào)告[15-16]。

分別將x和c作為2 個(gè)獨(dú)立分布的總體，獲得特定的分布特征和參數(shù)，在這2 個(gè)總體中進(jìn)行隨機(jī)抽樣并配對(duì)相乘，并使用m進(jìn)行校正，從而獲得y的概率分布。該模型的變異程度使用暴露量分布的特征統(tǒng)計(jì)量（如平均值等）和百分位點(diǎn)值表示。

健康指導(dǎo)值的設(shè)定能為風(fēng)險(xiǎn)管理者提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的定量信息，從而做出保護(hù)人類健康的決策。根據(jù)健康的劑量-反應(yīng)關(guān)系，攝入50 mg生物胺并不會(huì)引起毒性反應(yīng)。當(dāng)攝入75 mg及以上生物胺時(shí)，可能導(dǎo)致充血、腹瀉、頭痛等癥狀[17-19]。因此，本研究以安全閾值較低的50 mg作為無(wú)毒性參考劑量（reference no toxicological dose，RFNTD）。使用健康指導(dǎo)值安全日攝入量（safe daily intake，SDI），根據(jù)定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果給出建議攝入范圍。

中國(guó)人群建議的紅曲霉干酪SDI按式（2）計(jì)算。

式中：c為紅曲霉干酪中生物胺含量/（mg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用@Risk 7.0軟件（Palisade公司）的Monte-Carlo模擬，在式（1）中2 個(gè)獨(dú)立分布總體中進(jìn)行隨機(jī)抽樣，并配對(duì)運(yùn)算，得到概率分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟時(shí)間對(duì)紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

圖 1 成熟時(shí)間對(duì)紅曲霉干酪生物胺含量的影響Fig. 1 Influence of ripening time on biogenic amines contents in Monascus-fermented cheese

由圖1可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，紅曲霉干酪中生物胺含量的變化存在以下特點(diǎn)：紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺，其他生物胺均未檢出，其中酪胺在成熟前期（＞3 d）出現(xiàn)，β-苯乙胺在成熟后期（＞14 d）出現(xiàn)，酪胺和β-苯乙胺可能是紅曲霉干酪中的典型生物胺；總生物胺含量隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，成熟14 d后，由于β-苯乙胺的出現(xiàn)增加更為快速，14 d的成熟時(shí)間可能是紅曲霉干酪生物胺控制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。由于苯乙胺的毒性閾值較酪胺更低[17]，因此，生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免β-苯乙胺的生成，在風(fēng)味、質(zhì)地等滿足質(zhì)量要求的前提下，紅曲霉干酪成熟時(shí)間應(yīng)盡量縮短。

2.2 成熟溫度對(duì)紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

表 1 不同成熟條件下紅曲霉干酪中生物胺含量Table 1 Concentrations of biogenic amines in Monascus-fermented cheese under different ripening conditions

由表1可知：成熟溫度較低（10～14 ℃）時(shí)，紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺，且這2 種生物胺含量均隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中酪胺含量高于β-苯乙胺；成熟溫度較高（20 ℃）時(shí)，除了β-苯乙胺和酪胺之外，組胺也開(kāi)始生成，但含量低于前兩者。值得注意的是，當(dāng)成熟溫度上升時(shí)，3 種生物胺的增長(zhǎng)均較為快速，出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)也提前。其中，酪胺生成較β-苯乙胺和組胺更多、含量增加更為迅速，出現(xiàn)也相對(duì)最早（成熟溫度10 ℃，成熟時(shí)間＞7 d）。

由于成熟時(shí)間會(huì)影響干酪風(fēng)味物質(zhì)的形成[18,20]，因此在風(fēng)味、質(zhì)地區(qū)別不大的前提下，紅曲霉干酪的成熟時(shí)間為14～21 d，有利于避免產(chǎn)生較高含量的生物胺。本研究在全面考察風(fēng)味、質(zhì)地、生物胺等因素后，將紅曲霉干酪的成熟條件定為14 ℃、12～14 d。

2.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全攝入評(píng)估

按以上成熟條件制作9 批紅曲霉干酪，并檢測(cè)其中的生物胺含量。使用1.3.3節(jié)方法評(píng)估紅曲霉干酪中生物胺在中國(guó)人群中的安全性。

由表2可知，當(dāng)紅曲霉干酪中生物胺的暴露量為49.42 μg/（kg·d）時(shí)，97.5%人群具有暴露風(fēng)險(xiǎn)；而暴露量升高到94.72μg/（kg·d）時(shí)，則99%的人群處于暴露風(fēng)險(xiǎn)中。

表 2 中國(guó)人群對(duì)紅曲霉干酪中生物胺的暴露評(píng)估結(jié)果Table 2 Exposure assessment to biogenic amines in Monascusfermented cheese in Chinese population

表 3 中國(guó)人群對(duì)紅曲霉干酪的SDITable 3 SDI of Monascus-fermented cheese in Chinese population

對(duì)中國(guó)地區(qū)人群來(lái)說(shuō)，針對(duì)經(jīng)由膳食暴露的紅曲霉干酪中生物胺而引發(fā)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。由表3可知，為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全，建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過(guò)58 g/d。

3 結(jié) 論

紅曲霉干酪是一種以中國(guó)傳統(tǒng)食品原料紅曲作為霉菌發(fā)酵劑制成的新型干酪。本研究對(duì)紅曲霉干酪中生物胺的種類、數(shù)量、在成熟過(guò)程中的變化及其安全性評(píng)估作了較為系統(tǒng)的研究。

紅曲霉干酪中生物胺含量隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)、溫度的增加呈增加趨勢(shì)，酪胺、β-苯乙胺和組胺是其中檢出的3 種典型生物胺。β-苯乙胺多出現(xiàn)在成熟后期（＞7 d），組胺出現(xiàn)在成熟溫度較高（＞14 ℃）的條件下，相比之下，酪胺的含量和增長(zhǎng)速率均高于其他2 種生物胺，出現(xiàn)時(shí)間也最早。在紅曲霉干酪實(shí)際生產(chǎn)中，為減少生物胺的生成同時(shí)保證良好風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特性，成熟條件應(yīng)在溫度和時(shí)間2 個(gè)重要影響因素中選擇適當(dāng)?shù)钠胶恻c(diǎn)。本研究表明，成熟溫度14 ℃、成熟時(shí)間12～14 d是紅曲霉干酪較為適宜的成熟條件。

以紅曲霉干酪生物胺含量檢測(cè)數(shù)據(jù)、膳食調(diào)查和人群體質(zhì)量為基礎(chǔ)的紅曲霉干酪生物胺暴露評(píng)估結(jié)果表明，中國(guó)人群紅曲霉干酪生物胺暴露平均值為8.55 μg/（kg·d），P99百分位值為94.72 μg/（kg·d），以該暴露評(píng)估結(jié)果為基礎(chǔ)得到中國(guó)人群紅曲霉干酪的健康指導(dǎo)值。為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全，建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過(guò)58 g/d。