自體富血小板凝膠聯(lián)合脂肪干細(xì)胞促進糖尿病足大鼠創(chuàng)面修復(fù)的機制研究*

馮召嵐 盛健健 董愛武 李江雄 曹玲玲

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，患者足部潰爛，創(chuàng)傷難愈，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致截肢及死亡[1]。相關(guān)調(diào)查顯示，約15%的糖尿病患者遭受足部潰爛的折磨，全球范圍內(nèi)每20 秒就有1 例因糖尿病而截肢的患者，而70%的截肢患者往往在5 年內(nèi)死亡[2]。糖尿病足的高截肢率及高死亡率嚴(yán)重威脅患者生命安全，因此積極探究糖尿病感染性慢性創(chuàng)面的治療，刻不容緩。富血小板（platelet-rich plasma，PRP）凝膠是靜脈血梯度離心分離后，以氯化鈣及牛凝血酶激活的產(chǎn)物，含有多種生長因子，有利于細(xì)胞增殖[3]。Elsaid 等[4]分別給予糖尿病足患者PRP 凝膠外敷及生理鹽水處理，發(fā)現(xiàn)PRP 凝膠具有明顯縮小患者足部潰瘍面積的作用。秦新愿等[5]研究指出，PRP 局部注射在促進糖尿病足潰瘍創(chuàng)面修復(fù)方面效果良好。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有分化為表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的多向分化潛能，可有效促進創(chuàng)面愈合。此前，國內(nèi)外多項研究證明，PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 治療皮膚創(chuàng)傷，效果明顯[6-7]。但關(guān)于其治療機制，研究甚少。本研究分析了磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）/ 蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路在PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 治療糖尿病足中的作用，現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 78 只8 周齡清潔級雄性大鼠，體重200～240 g，購自上海美軒生物科技有限公司，合格證號：11400700197085。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)6 周，室溫控制在20 ℃左右，濕度控制在60%～70%。本實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，實驗操作符合相關(guān)動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要實驗試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigmag），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，美國Hyclone），檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，阿根廷Natocor），蘇木精-伊紅染色劑（hematoxylin-eosin staining，HE，中國上海索萊寶），CD31 抗體（美國Abcam）、PI3K/Akt 抗體（美國Abcam），TRETrizol（美國Thermofisher），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，中國上海生工），Primers（中國上海生 工），SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ（日 本TaKaRa），PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（日 本TaKaRa），Ⅰ型膠原酶（美國Thermofisher），胰蛋白酶（中國上海生工），乙二胺四乙酸鹽（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國Thermofisher），鏈霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），DAB 辣根過氧化物酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），高糖高脂飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司），配方為：豬膽鹽0.3%，膽固醇1.5%，蔗糖20%，精煉豬油10%，普通飼料68.2%；高速離心機（3K15，德國SIGMA），Real Time PCR 儀（CFX96，美國BioRad），光學(xué)顯微鏡（DP71，日本Olympus），NanoDrop2000 超微量分光光度計（美國Thermofisher）。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病足裸鼠模型的建立 78 只大鼠隨機取15 只作為正常組，予以常規(guī)清潔級飼料。其余63 只予以高糖高脂飼料。喂養(yǎng)6 周后，禁食12 h，進行第一次STZ 腹腔注射，以0.1 mmol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 為4.4）配制為1%的STZ 注射液，現(xiàn)配現(xiàn)用，經(jīng)濾過處理后，以150 mg/kg 進行腹腔注射。注射第3 天進行尾靜脈取血，檢測血糖水平（血糖≥16.7 mmol/L 為達標(biāo)），標(biāo)記不合格大鼠；于第7 周進行第二次STZ 腹腔注射，操作方法同前，注射第3 天檢測尾靜脈血糖；對于血糖升高不明顯大鼠，于第8 周進行第3 次STZ 腹腔注射；剔除三次干預(yù)后，血糖含量仍不達標(biāo)大鼠。

采用燙傷法建立糖尿病足與創(chuàng)傷模型：待糖尿病模型大鼠出現(xiàn)明顯的熱痛覺、觸覺異常等神經(jīng)病變癥狀時，采用燙傷板在大鼠后足的左側(cè)做一5 mm×5 mm 的創(chuàng)傷，并將燙傷處浸入70 ℃的水中8 s，建立糖尿病足大鼠模型，使用硅膠板對創(chuàng)面邊緣進行固定，防止創(chuàng)面過早愈合。本研究中63 只SD 大鼠，60 只糖尿病足模型建立成功，其中2 只血糖水平不達標(biāo)，1 只因高血糖死亡。正常組大鼠也按照上述方法在后足左側(cè)建立創(chuàng)傷模型。

1.3.2 PRP 凝膠的制備 采用改良Cascade-Esforax 法制備PRP 凝膠[8]，使用Ca2+激活。采用7%（0.3 mL/100 g）水合氯醛（生產(chǎn)廠家：西安天正藥用輔料有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37022673，規(guī)格：500 g）腹腔注射麻醉大鼠，取5 mL 注射器，吸取0.3 mL 4%的枸櫞酸鈉抗凝劑（生產(chǎn)廠家：伊勢久生物科技有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20058912，規(guī)格：100 mL），注射器連接硬膜外管，于大鼠頸靜脈處取3 mL 靜脈血，以1 100 g 離心10 min；而后加入0.3 mL 的氯化鈣（生產(chǎn)廠家：西寶生物科技股份有限公司，批準(zhǔn)文號：AHD0004H，規(guī)格：500 g）50 mg/mL 以激活，靜置后，中間淡黃色凝膠即為PRP 凝膠，留取備用。

1.3.3 ADSCs 的分離和培養(yǎng) 將實驗大鼠進行腹腔麻醉后，取兩側(cè)腹股溝脂肪墊組織，用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗后剪碎至靡狀，0.2%Ⅰ型膠原酶恒溫消化40 min，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中和，1 500 r/min離心10 min，去除雜質(zhì)及上清；沉淀混勻后采用200 目濾網(wǎng)過濾，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清；采用含有10%FBS 的DMEM/F12 混懸細(xì)胞，按照2×104個/瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)；將原代細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2及飽和恒溫培養(yǎng)箱中，48 h 換液。待原代細(xì)胞融合至80%左右時開始傳代：棄去原培養(yǎng)液以PBS 沖洗，采用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA 進行消化；消化結(jié)束后吹打細(xì)胞，使其充分懸浮，以1 000 r/min 離心5 min，用含有10%胎牛血清及1%鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，按1︰3 比例進行傳代，當(dāng)傳代細(xì)胞單層匯合達70%以上時可繼續(xù)傳代；留取生長良好的第3 代細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.3.4 動物模型分組與創(chuàng)面干預(yù) 按照創(chuàng)面干預(yù)方式將60 只建模成功的大鼠分為模型對照組、PRP組、ADSCs 組、PRP+ADSCs 組各15 只。正常組、模型對照組創(chuàng)面滴加0.2 mL 生理鹽水；PRP 組創(chuàng)面滴加PRP 凝膠0.2 mL；ADSCs 組創(chuàng)面滴加ADSCs 0.2 mL（2×104個細(xì)胞/mL）；PRP+ADSCs 組滴加ADSCs-PRP 復(fù)合物0.2 mL（2×104個細(xì)胞/mL）。

1.3.5 RT-PCT 檢測PI3K、Akt mRNA 的表達 分別于創(chuàng)傷后3、7、10、14 d 時，每組隨機取3 只大鼠，觀察其創(chuàng)面恢復(fù)情況。采用Trizol 法提取愈傷組織總RNA，運用NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度（OD260/230約為2.2，OD260/280為1.8～2.2）；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa）制作cDNA 文庫，配制10 μL 反應(yīng)體系；采用iTaq?Universal SYBR?Green Supermix 熒光定量酶（上海生工）及RT-PCR 儀（美國，BioRad）進行PCR 擴增反應(yīng)，采用3 步法擴增，參數(shù)設(shè)置：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；62℃ 30 s，72 ℃ 10 s，95 ℃10 s，45 個循環(huán)；溶解曲線為75 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s。從PCT 儀中導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計算目的基因的mRNA 相對表達水平，以GraphPad Prism 7.0繪制柱狀圖。以GAPDH 為內(nèi)參基因，RT-PCR 引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.3.6 組織標(biāo)本的制備與處理 創(chuàng)傷后3、7、10、14 d，每組隨機處死3 只大鼠，取愈傷組織為實驗標(biāo)本，采用4%甲醛固定，梯度脫水、浸蠟、包埋后制作成厚度為4 μm 的切片，行HE 染色。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、PI3K、Akt 表達檢測：分別采用相應(yīng)的抗體共孵育后，滴加DAB辣根過氧化物酶顯色后，采用HE 復(fù)染，梯度脫水，透明，風(fēng)干后封片，采用PBS 為陰性對照，顯微鏡下閱片、分析。由2 名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進行閱片，隨機選取光學(xué)顯微鏡下的5 個視野，記錄CD31 細(xì)胞陽性表達率，視野下以細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；采用Image Pro Plus 6.0 軟件處理免疫組化圖片，計算光密度值（optical density，OD），取每張切片的5 個視野設(shè)為平均OD值，統(tǒng)計PI3K、Akt 表達OD 值。

1.4 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn) 觀察各組大鼠干預(yù)3、7、10、14 d 時的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=（創(chuàng)面初始面積-未愈合面積）/創(chuàng)面初始面積×100%，統(tǒng)計各組創(chuàng)面愈合時間；免疫組化法檢測各組干預(yù)3、7、10、14 d 時CD31 細(xì)胞陽性表達率及PI3K、Akt 蛋白表達OD 值；RT-PCT 檢測各組干預(yù)3、7、10、14 d 時PI3K、Akt mRNA 表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7.0 進行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制，各組不同時間點創(chuàng)面愈合率、PI3K、Akt 表達OD 值等計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，方差齊兩兩比較采用LSD 檢驗；P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點創(chuàng)面愈合率及完全愈合時間比較 隨著時間的延長，各組創(chuàng)面愈合率呈上升趨勢，組間及時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PRP+ADSCs 組、正常組干預(yù)3、7、10、14 d 時的創(chuàng)面愈合率均顯著高于PRP 組、ADSCs 組及模型對照組（P<0.05），而PRP+ADSCs 組與正常組組間同時間點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；PRP+ADSCs 組、正常組的創(chuàng)面完全愈合時間顯著早于PRP 組、ADSCs 組及模型對照組（P<0.05），而ADSCs 組和PRP 組創(chuàng)面愈合時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組不同時間點創(chuàng)面愈合率及完全愈合時間比較（）

表2 各組不同時間點創(chuàng)面愈合率及完全愈合時間比較（）

*與同時間點PRP+ADSCs 組及正常組比較，P<0.05；#與同時間點ADSCs 組比較，P<0.05；△與同時間點模型對照組比較，P<0.05。創(chuàng)面愈合率：F組間=525.400，P組間=0.001；F時間=3 705.000，P時間=0.001。創(chuàng)面完全愈合時間：F組間=10.181，P組間=0.001。

2.2 各組不同時間點CD31 細(xì)胞陽性表達率比較 隨著時間的延長，各組間CD31 細(xì)胞陽性表達率呈上升趨勢，組間及時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；PRP+ADSCs 組、正常組干預(yù)3、7、10 及14 d 時的CD31 細(xì)胞陽性表達率均顯著高于PRP 組、ADSCs 組及模型對照組（P<0.05）。見表3。

表3 各組不同時間點CD31細(xì)胞陽性表達率比較[%，（）]

表3 各組不同時間點CD31細(xì)胞陽性表達率比較[%，（）]

*與同時間點PRP+ADSCs 組及正常組比較，P<0.05；#與同時間點ADSCs 組比較，P<0.05；△與同時間點模型對照組比較，P<0.05。F組間=457.100，P組間=0.001；F時間=655.600，P時間=0.001。

2.3 各組不同時間點PI3K、Akt 表達OD 值比較 大鼠創(chuàng)傷組織PI3K、Akt 表達OD 值的組間及時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中PRP+ADSCs 組和正常組干預(yù)3、7 及10 d 時的PI3K、Akt 表達OD 值均顯著高于PRP 組、ADSCs組及模型對照組（P<0.05），見表4。

表4 各組不同時間點PI3k、Akt蛋白表達OD值比較（）

表4 各組不同時間點PI3k、Akt蛋白表達OD值比較（）

表4（續(xù)）

2.4 各組不同時間點愈創(chuàng)組織中PI3K、Akt mRNA相對表達情況比較 RT-PCR 數(shù)據(jù)分析顯示，當(dāng)將模型對照組設(shè)為單位一時，PRP+ADSCs 組、ADSCs組、PRP 組及正常組大鼠的PI3K、Akt mRNA 表達量出現(xiàn)顯著上調(diào)，見表5。

表5 各組不同時間點愈創(chuàng)組織中PI3k、Akt mRNA相對表達量（）

表5 各組不同時間點愈創(chuàng)組織中PI3k、Akt mRNA相對表達量（）

3 討論

糖尿病潰瘍創(chuàng)面由于組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生病理性改變，不利于創(chuàng)面肉芽組織生長，故難以愈合[9]。PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 是目前治療皮膚創(chuàng)面損傷的常用手段，PRP 凝膠可抑制血管病變，減輕炎癥反應(yīng)，ADSCs 可刺激真皮外基質(zhì)膠原的合成，加快創(chuàng)面恢復(fù)[10]。PI3K/Akt 信號通路廣泛存在多種細(xì)胞中，具有調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等作用[11]。本研究通過CD31 細(xì)胞陽性表達率檢測創(chuàng)面血管生成情況，通過免疫組化檢測PI3K、Akt 蛋白表達水平，通過PT-PCR 檢測PI3K、Akt mRNA 的相對表達量，以分析PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 治療糖尿病足治療的可能機制。

本研究中分別給予各組實驗鼠PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs、單獨PRP 凝膠、單獨ADSCs 等干預(yù)，結(jié)果顯示，PRP+ADSCs 組創(chuàng)面愈合時間早于PRP 凝膠或ADSCs 單獨使用組，早于模型對照組。說明給予糖尿病潰瘍創(chuàng)面單一PRP 凝膠或ADSCs 干預(yù)均可有效促進創(chuàng)面修復(fù)，但二者聯(lián)合效果更佳。分析原因，ADSCs 雖可分泌血管內(nèi)皮生長因子、成纖維生長因子等多種促進病灶新生血管生長的有效成分。但單一的生長因子在促進細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移方面作用甚微，當(dāng)多種細(xì)胞因子相結(jié)合時才可發(fā)揮效用[12]。PRP 凝膠中的血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因 子-β（transforming growth factor β，TGF-β）等可調(diào)控ADSCs 的旁分泌作用，加速成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，促進創(chuàng)面修復(fù)[13]。同時，PRP 凝膠還具有抑制創(chuàng)面感染的作用，其特有的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可為ADSCs 提供生物支架，有利于ADSCs 持續(xù)釋放生長因子，促進局部微血管生成，增加血供，促進細(xì)胞外基質(zhì)及膠原合成，增強創(chuàng)面上皮化能力[14]。PRP 凝膠與ADSCs 二者聯(lián)合可相互協(xié)同，促進創(chuàng)面恢復(fù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著時間的增長，各組間CD31 細(xì)胞陽性表達率明顯升高，且PRP+ADSCs 組、正常組、PRP 組、ADSCs 組的表達率均顯著高于模型對照組。CD31 在內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及T 細(xì)胞亞群中廣泛表達，是血管內(nèi)皮相關(guān)的標(biāo)志性蛋白[15]。CD31 陽性表達率的升高，進一步證明PRP 凝膠及ADSCs 干預(yù)有利于創(chuàng)面新生血管生成。

PI3K 是由催化亞基p110 和調(diào)節(jié)亞基p85 組成的二聚體蛋白，可分為Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型3 類，其中Ⅰ型PI3K 研究較為廣泛，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。PI3K 中的調(diào)節(jié)亞基p85 可與細(xì)胞表面的各類受體相互作用，引發(fā)自身構(gòu)象改變，從而催化p110 激活PI3K；活化后的PI3K 可產(chǎn)生第二使信分子3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，該信號分子可 與Akt 的Pleckstrin 同源性（pleckstrin homology，PH）結(jié)合域相結(jié)合，引發(fā)其蛋白構(gòu)象改變，促進Ser473 和Thr308 位點的磷酸化；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）可通過調(diào)控動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）等下游靶基因，完成細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物過程[17]。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，干預(yù)3、7、10 d 時，各組PI3K、Akt 蛋白表達OD 值均明顯升高，且PRP+ADSCs 組、ADSCs 組、PRP 組均顯著高于模型對照組，說明PRP 凝膠及ADSCs 干預(yù)可有效激活PI3K/Akt 信號通路。RT-PCR mRNA表達分析顯示，隨著干預(yù)時間的延長，各組PI3K、Akt mRNA 表達水平呈上升趨勢，干預(yù)14 d 時隨著創(chuàng)面愈合率的增長，PI3K、Akt mRNA 表達量呈下降趨勢，以PRP+ADSCs 及正常組最為顯著，進一步證明PI3K/Akt 信號通路的激活是PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 治療糖尿病足的可能機制。Chen 等[18]研究指出，重組人血小板源性生長因子-BB（recombinant human platelet-derived growth facto，rhPDGF-BB）與人脂肪源性干細(xì)胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）可通過上調(diào)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）及p-Akt 水平以激活PI3K/Akt 信號通路，促進跟腱炎康復(fù)。

綜上所述，自體PRP 凝膠聯(lián)合ADSCs 在治療糖尿病潰瘍型創(chuàng)面方面效果良好，這可能與PI3K/Akt 信號通路的激活相關(guān)。另外，本研究還存在明顯不足：僅對PI3K、Akt 的蛋白及mRNA 的表達情況進行探究，未分析PI3K/Akt 信號通路下游關(guān)鍵因子的表達情況；未采用LY294002 等PI3K/Akt 信號通路相關(guān)抑制劑進行對照研究，故實驗結(jié)論說服力不足，期待后續(xù)實驗中進一步完善。