新生兒膽道閉鎖發病機制的研究進展

李欣 張艷兵 房麗麗

膽道閉鎖（BA）目前仍然是小兒外科中最嚴重的肝膽系統疾病之一，且其治療效果不佳已達成共識。BA 累及肝內外膽管，雖然肝門-空腸吻合術（Kasai 手術）可以恢復部分膽汁引流，但是肝內膽汁淤積和肝纖維化的程度在術后可能會持續進展。肝移植技術的應用對于BA 的治療具有重大意義，使得許多BA 晚期發生肝功能衰竭的BA 患兒通過肝移植手術獲得長期生存的機會。目前，Kasai 術后綜合治療和兒童肝移植的發展使得BA 術后10 年的總生存率已達到90%[1]。但新生兒發生BA 的發病機制尚不明確，不能在圍生期進行篩查或早期診斷，使得BA 在發現時已經出現不同程度膽汁淤積和肝纖維化。因此，探究BA 的發病機制對疾病的預防、早期診斷及治療具有重要意義。本文對BA 發病機制的最新研究進行闡述。

1 BA的相關基因

BA 是一種肝臟內膽管異常狹窄、阻塞或完全缺失的新生兒膽管疾病。已有研究報道了許多可能導致BA 的病因，包括先天性、圍生期和后天性疾病[2]。目前發現多個基因與BA 相關。在一項評估microRNA-499 rs3746444 多態性與BA 風險的關聯及其與BA 臨床病理特征相關性的研究中，通過使用熒光標記探針在Rotor Gene Real Time PCR System（QIAGEN，GmbH）上進行實時聚合酶鏈反應（PCR）熒光檢測，對所有參與研究的BA 嬰兒及健康對照組的miR-499 單核苷酸多態性（SNP）（rs3746444 A>G）進行基因分型。發現miR-499 SNP 基因型與BA 的發生存在關聯，變異等位基因G 是BA 的主要等位基因[3]。此外EFEMP1 基因也可能是BA 患者新的易感基因，研究發現EFEMP1 轉錄物在膽管細胞和門靜脈成纖維細胞中具有更高的表達[4]。而肝臟和血清外泌體長鏈非編碼RNA H19（lncRNAH19）也通過影響膽管細胞參與BA 的病程，H19 水平升高導致高遷移率組AT-hook 2（HMGA2）的上調，增強膽道細胞增殖，H19 缺乏通過抑制膽汁酸誘導的S1PR2 和鞘氨醇激酶2（SphK2）的表達和激活來抑制膽管細胞增殖和肝纖維化[5]。Hes1 siRNA 抑制膽管上皮細胞成熟，導致膽管上皮細胞保持未成熟狀態，無法形成管狀結構[6]。另一段長非編碼RNA（lncRNA）膜聯蛋白A2 假基因3（ANXA2P3）和膜聯蛋白A2（ANXA2）也被發現在BA 患者中表達水平增加，ANXA2P3 和ANXA2 的表達與肝細胞增殖、細胞周期進程及肝細胞凋亡密切相關，并且被認為可能是BA 患者的生物標志物[7]。

2 BA與病毒感染及炎癥反應

病毒感染通常被認為是BA 發病機制的始動因素。最常涉及的病毒載體包括皰疹病毒科（巨細胞病毒和Epstein-Barr 病毒）以及呼腸孤病毒科（呼腸孤病毒和輪狀病毒）的成員[2]。在BA 和輪狀病毒誘導的BA 小鼠的肝臟中，JAG1 和Notch2 的表達顯著增加。抑制Notch 通路可改善膽管阻塞并延遲BA 誘導的死亡率。通過抑制Notch 通路，炎癥細胞因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-8（IL-8）和白細胞介素-18（IL-18）]的血清水平降低。BA 肝臟中CK19、Sox9 和EpCAM 的表達顯著增加，Notch 通路通過促進肝祖細胞向膽管細胞分化而參與BA 的發病機制[8]。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是炎癥中的關鍵信號分子，BA 肝組織中的STAT3 和p-STAT3 表達降低。RNA-seq 分析顯示BA 中表達STAT3 的中性粒細胞數量減少，同時干擾素相關的抗病毒活性顯著增強。STAT3 減少，增強IL-8 和中性粒細胞化學引誘物（C-X-C 基序）配體1（CXCL1）表達并促進干擾素反應性中性粒細胞的積累，導致BA 中的膽管上皮細胞損傷[9]。而miR-155 過表達促進主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ、MHCⅡ、趨化因子（CXC 基序）配體（CXCL）9、CXCL10、單核細胞趨化蛋白1 和IFN-γ 刺激后的CXCL1 的表達，激活JAK2/STAT3，從而增強促炎作用[10]。研究發現BA 患者的肝臟炎癥小體基因的表達增加，使用經過改造以滅活攜帶炎癥小體基因的小鼠，IL1R1 或NLRP3 的缺失、自然殺傷細胞的激活以及細胞因子和趨化因子的表達減少，從而防止了上皮損傷和膽管阻塞[11]。高遷移率族框1（HMGB1）作為炎癥的晚期介質起著重要作用。和健康對照患者相比，從BA 患兒采集的血清中HMGB1 水平顯著升高。BA 患兒血清HMGB1 水平與γ-谷氨酰轉移酶水平呈正相關，BA 肝活檢組織中HMGB1 信使核糖核酸和蛋白質表達水平上調，血清HMGB1 水平與γ-谷氨酰轉移酶水平的相關性可能為BA 的診斷提供新的標志物[12]。

3 BA與免疫反應

越來越多的證據表明免疫反應參與了BA 的發病機制[13]，在恒河猴輪狀病毒（RRV）誘導的新生BA 小鼠模型中，缺乏B 細胞的小鼠不會發生BA，并且缺乏B 細胞與T 細胞和巨噬細胞活化的喪失有關。來自BA 小鼠的B 細胞產生了多種與免疫激活相關的先天性和適應性免疫細胞因子，B 細胞分泌的細胞因子可根據T 細胞活化標記分化簇的表達增加來激活T 細胞，增加巨噬細胞浸潤和膽道損傷[13]。BA 患者門脈中的淋巴細胞浸潤主要表現CD3、CD4和CD8T 細胞顯著升高，CD4+T 細胞活化已被證明在BA 中發揮重要作用，評估匯管區CD4+T 細胞亞群的浸潤水平的研究發現，BA 患者的肝臟浸潤性Th1、Th2、Th17 細胞顯著增加，并且與預后呈負相關[14-15]。在小鼠模型中，激活的CD4+淋巴細胞在病毒攻擊后第8 天開始出現在肝臟中，而先天免疫反應正在減弱。血漿白細胞介素-17A（IL-17A）水平隨著Th17 淋巴細胞和髓樣樹突細胞的肝積累而上升。分化簇11c（CD11c）樹突狀細胞的靶向消耗減少了肝臟IL-17A 的產生并改善了肝內膽管損傷。重組IL-17A 在體外誘導新生兒膽管細胞中趨化因子（C-C 基序）配體2 的表達，并且阻斷相應的趨化因子（C-C 基序）受體2 減少了體內炎癥巨噬細胞向肝臟的募集[16]。而巨噬細胞分泌的TNF-α 及其兩個受體TNFR1 和TNFR2 表達增加，減少了細胞凋亡和上皮損傷，抑制T 細胞、肝樹突狀細胞和NK 淋巴細胞對肝臟的浸潤，預防肝外膽管阻塞[17]。

4 BA與膽管增生

Hippo 信號通路參與BA 的發生發展，Yes 相關蛋白（YAP）是Hippo 信號通路的一種效應子，YAP 表達促進了膽管細胞和肝細胞的增殖，與膽管增生、維持膽管細胞的特性至關重要。此外，被確定為YAP 靶基因的ANKRD1 在BA 肝臟中也高表達。YAP 和ANKRD1 在RRV 誘導的BA 小鼠模型中顯著上調，可能與BA 的膽管增生有關[18]。TGF-β 信號通路參與BA 的膽管變性過程，異常的轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達模式與BA期間正常導管板重塑過程中的發育停滯有關，并且可能是上皮-間充質相互作用障礙的基礎，發育關鍵時期的TGF-β 信號傳導，尤其是TGF-βRⅡ，可以防止肝外膽道系統的喪失[19]。GATA6 是一種與膽道發育有關的轉錄因子，BA 患者的肝細胞中GATA6 表達顯著上調。BA 肝臟中GATA6 的表達與已知的膽管細胞分化調節因子（JAGGED1、HNF1β 和HNF6）的表達相關，GATA6 是BA 中肝細胞-膽管細胞化生的新標志物和推定的驅動因素。使用細胞轉染模型，證明了GATA6 在HepG2 細胞或原代人肝細胞中的強制表達誘導基因表達模式向膽管細胞表型的轉變，表明GATA6 在BA 發病機制中的功能作用。GATA6 過表達誘導了幾個對早期膽管發育很重要的基因，包括HNF1、HNF6、JAG1和DKK1。GATA6 過表達后基因表達的變化很可能是逐漸發生的，經過更長的培養時間，更多的膽管細胞譜系標志物可以上調[20]。

5 BA與肝纖維化

BA 的纖維化過程涉及膽管損傷和膽管細胞凋亡，膽管細胞通過增加纖維化細胞因子、TGF-β1和血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）的表達來對損傷做出反應。研究發現，BA 中纖維化的快速進展與轉錄因子SOX9 和肝祖細胞增殖顯著相關[21]。在BA 中表達干/ 祖細胞標志物PROMININ-1（PROM1）的上皮-間充質肝祖細胞在膽道纖維化的發展區域內經歷擴增，并隨后分化為產生膠原蛋白的肌成纖維細胞，促炎性Toll 樣受體3（TLR3）激活部分通過TGF-β 通路激活誘導PROM1 和肝祖細胞的肌成纖維細胞分化，以促進BA 相關膽管纖維化[22-23]。研究觀察到調節性T 細胞缺乏以及BA 患者外周血和肝臟中Th1、Th2 和Th17 含量增加，Th1 細胞靠近活化的肝星狀細胞和BA 肝臟中的纖維化區域，通過IFN-γ/STAT1 途徑加速肝星狀細胞促纖維化標志物的增殖和分泌，導致細胞外基質沉積和纖維化增加[24]。在活化的肝星狀細胞中miR-19b 顯著下調，降低的α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達，并對肝星狀細胞活化產生抑制作用，miR-19b 水平與兒科終末期肝病評分呈負相關[25]。在肝星狀細胞中miR-145 的表達顯著下調，使內收蛋白3（ADD3）的表達增加，導致BA中的肝纖維化[26]。除此之外，研究發現自分泌運動因子（ATX）具有由溶血磷脂酸活性引起的促纖維化作用。BA 患者和對照的外周血白細胞和肝組織中ATX 表達和ATX 啟動子甲基化分析顯示，晚期BA 患者的ATX 啟動子甲基化水平低于早期BA 患者，ATX 表達顯著升高并與BA 患者的ATX 啟動子甲基化降低相關。ATX 的啟動子低甲基化和過度表達與BA 患者的黃疸狀態、肝功能障礙和肝臟僵硬呈負相關。因此，假設外周血中ATX 啟動子甲基化和ATX 表達可能作為反映術后BA 中肝纖維化進展的生物標志物。這些發現表明ATX 的啟動子低甲基化和過度表達可能在BA 肝纖維化的發病機制中發揮了促進作用[27]。

6 BA與膽汁酸

在BA 肝臟中實質肝細胞（包括肝細胞和膽管細胞）之間的緊密連接和極性復合物受到嚴重破壞。緊密連接和極性復合物是在維持膽汁屏障和運輸方面發揮基本作用的結構。屏障不完整導致膽汁腐蝕上皮和黏膜下組織，從而破壞管腔結構，進一步加重膽汁淤積和肝損傷。研究發現BA 肝臟中膽管細胞和肝細胞的細胞連接和極性復合物的組裝存在顯著缺陷[28]。這種缺陷的特點是細胞連接蛋白（ZO1、β-catenin、E-cadherin 和claudin-3）的位置紊亂。Cdc42 及其活性形式Cdc42-GTP 在BA 肝臟中顯著減少，伴隨著上皮連接和細胞極性的破壞與肝細胞中細胞連接和極性復合物的組裝受損密切相關，并因膽汁酸腐蝕而加劇[28]。

miRNA 在生物學中發揮重要作用。研究發現BA 小鼠的先天細胞因子和miRNA 的mRNA 表達顯著增加，這些細胞因子和miRNA 與膽汁酸轉運蛋白/ 核受體（miRNA-22-5p、miRNA-34a-5p 和miRNA-222-3p）相結合，降低膽汁酸轉運蛋白和核受體的mRNA 表達。TNF-α 和IL-1β 增加了miRNA 34a-5p 和miRNA 222-3p 的表達，然后這些miRNA 降低了多種膽汁酸轉運蛋白和核受體的表達，膽汁酸轉運蛋白的喪失會通過膽汁酸滯留增加肝毒性[29]。當膽汁酸與腸上皮中的法尼醇X 受體結合時，會誘導成纖維細胞生長因子（FGF）19 的表達。然后，FGF19 由門靜脈流轉運，通過細胞外信號調節激酶（ERK）途徑導致細胞色素P450、家族7、亞家族A、多肽1（CYP7A1）（膽汁酸生物合成的關鍵酶）的轉錄抑制。因此FGF19 在BA 肝細胞中增加且FGF19 通路不會抑制膽汁酸合成[30]。

7 BA與腸道微生物

腸道微生物組在宿主代謝、營養和免疫功能中發揮著重要作用，其多樣性和/或組成發生改變，稱為生態失調，在疾病狀態（包括肝臟疾?。┲杏兴枋?。成年期肝腸微生物組的探索主要集中在非酒精性肝病、肝硬化（主要是酒精或病毒性病因）和膽汁淤積性肝病（如原發性硬化性膽管炎），微生物特征與疾病嚴重程度相關。BA 中腸道微生物群的研究僅限于基于培養的方法，但分子研究正在興起，雖然處于起步階段，但強調了腸桿菌科和鏈球菌的潛在致病作用，以及雙歧桿菌的潛在有益作用。細菌易位和腸道微生物組衍生代謝物的產生是肝病發病機制中的關鍵宿主微生物組機制途徑[31]。BA 在微生物組中表現出較低的多樣性和顯著的結構分離。在微生物分類單元中的門水平上，變形桿菌數量增加，而擬桿菌數量在BA 中減少。在微生物分類單元中的屬水平上，鏈球菌和克雷伯氏菌等幾種潛在病原體在BA 中顯著增加，而雙歧桿菌和幾種產丁酸鹽細菌的數量下降。在Kasai 手術后，微生物組也受到干擾。BA 的微生物分類單元顯示出與肝功能的顯著相關性。此外，鏈球菌/擬桿菌的豐度比在區分BA 與健康對照方面顯示出巨大的作用。BA 中腸道膽汁酸顯著降低，梭菌與初級/次級膽汁酸的比例呈正相關。腸道微生物生態失調，可能由膽汁酸減少引起，與肝功能有關，對BA 具有良好的診斷潛力[32]。

8 總結

綜上所述，BA 的發病機制與多種基因有關，這些基因通過影響膽管細胞及肝細胞的增殖與凋亡參與BA 的病程。病毒感染被認為是BA 的始動環節，炎癥反應及免疫反應通過多種炎癥細胞因子和免疫細胞因子導致膽管細胞損傷，多個信號通路影響膽管細胞增殖及變性。膽管細胞的損傷和增殖及炎癥反應促進肝臟發生肝纖維化。膽汁酸腐蝕上皮和黏膜下組織，破壞管腔結構，進一步加重膽汁淤積和肝損傷。腸道微生物也可能是BA 的潛在發病因素，對此仍需要進一步的研究，明確BA 的發病機制，為如何減少和避免BA 的發生提供新思路。