禽霍亂與大腸桿菌病多價二聯蜂膠滅活疫苗的研制

摘要：為研制禽霍亂與大腸桿菌病多價二聯滅活疫苗，本研究以禽多殺性巴氏桿菌強毒株C48_1、C48_2和禽致病性大腸桿菌常見血清型K88、K4等為制苗菌株，以牛肉湯進行高密度培養制備抗原，將滅活的抗原鋪以具有廣譜生物學活性的天然物質蜂膠為免疫增強劑，制備禽霍亂與大腸桿菌病多價蜂膠二聯滅活疫苗。試驗結果表明，疫苗安全可靠，無明顯的干擾現象，免疫后5-7d產生堅強保護力，對禽霍亂和雞大腸桿菌病的近期保護率均為87%，疫苗保護期為6個月。以實驗動物小鼠代替本動物進行二聯疫苗效檢取得成功，本效檢方法可縮短檢驗期限7d，降低檢驗成本，具有更敏感、更特異、更客觀、更簡便等特點。

關鍵詞：禽霍亂 大腸桿菌病 蜂膠 滅活疫苗

禽霍亂和禽大腸桿菌病是家禽的兩種流行廣泛而且危害嚴重的主要傳染病，給養禽業帶來重大的經濟損失。有關這兩種病的防治國內多以藥物防治為主，但由于大腸桿菌極易產生耐藥性，一旦停藥后，這兩種病又易反復發作，臨床應用效果不理想。反復用藥，還可導致菌群失調，造成更大的損失，甚至產生藥物殘留，造成食品安全危機，影響國際貿易。本研究在完成禽霍亂蜂膠滅活疫苗和禽大腸桿菌病多價蜂膠疫苗的基礎上研制出禽霍亂與大腸桿菌病多價蜂膠二聯滅活疫苗^[1]。

1 試驗材料

1.1 制苗用菌株。雞多殺性巴氏桿菌C48-1強毒株C48-2強毒株；雞致病性大腸桿菌強毒株2株，血清型分別為K88、K4型由預防實驗室保存。

1.2 試驗動物。試驗用雞購于圣景園畜禽養殖基地1日幼齡雛，飼養至40日齡。小白鼠購買于天碩生物制品公司。

1.3 試驗試劑與藥品。制苗用培養基為牛肉湯、甲醛、營養瓊脂、葡萄糖、氫氧化鈉、濃氨水、硫酸鋁鉀、蒸餾水等。

1.4 試驗器材。培養皿、試劑瓶、高壓鍋、水浴鍋、電爐、接菌環、酒精燈、手術刀、剪刀、注射器等^[2]。

2 試驗方法

2.1 疫苗的制備。雞多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌二聯滅活菌液按《獸用生物制品規程》方法制備。

2.1.1 制苗用培養基牛肉湯的制備：取2斤精瘦牛肉切成碎末加1000ml水放入高壓鍋加熱4-6h后冷卻后用四層紗布過濾，不足1000ml加蒸餾水補足，放入滅菌瓶中保存備用。用天平分別稱取5g氯化鈉、10g蛋白胨和1g葡萄糖放入上述牛肉湯中。調節牛肉湯的PH值至中性。將牛肉湯分別裝入2個500ml的滅菌瓶中每瓶500ml，放入高壓鍋中高壓滅菌備用。

2.1.2 氫氧化鋁膠的制備：濃氨水10mL加蒸餾水90mL，裝入瓶內。硫酸鋁鉀20g加蒸餾水200mL，加熱到60℃，放入瓶內。將（1）液加入到（2）液中，慢加快攪，當（1）液剩約10mL時，停止加入，測PH（6～9左右）。靜置棄上清，用蒸餾水洗3～4次，每次均靜置棄上清。測PH，分裝后再靜置，棄上清，高壓備用。

2.1.3 菌液培養：將菌種接種于普通肉湯，培養24小時后，進行大量擴增菌液至所需量后加甲醛滅活。

2.1.4 配苗：分別取雞多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌滅活菌液5份加滅菌氫氧化鋁膠1份，充分混合均勻后，靜置沉淀2-4d，棄去部分上清液，濃縮至全量的3/4，取樣做無菌檢驗。將無菌檢驗均合格的上述濃縮菌液按3：1的比例混合，并按混合后總量的0.005%加入硫柳汞，充分混勻^[3] 。

2.2 疫苗檢驗。物理性狀、無菌檢驗、安全性檢驗、效力檢驗等按《獸用生物制品規程》檢驗。

2.2.1 二聯疫苗對小鼠的免疫效力試驗。用二聯疫苗免疫實驗動物小鼠。將20g重的小鼠分為5組，1至4組每組各10只小鼠，第5組設為對照組為8只小鼠，1至4組每組免疫劑量為0.2mL/只，對照組每只注射0.2mL的生理鹽水。對小鼠免疫后的第7d、30d、60d、180d后分別對第1至4組用致死量禽霍亂和大腸桿菌菌液攻毒，測定免疫效力。對1至4組攻毒同時每次分別取對照組2只小鼠進行功毒。試驗小鼠攻毒后連續觀察7d，記錄各組發病、死亡情況^[4]。

2.2.2 二聯疫苗對本源動物雞的免疫效力試驗。對本源動物雞的測定。將40日齡雞分為5組，1至4組每組各30只，第5組設為對照組為8只，每組免疫劑量為1.5mL/只，對照組每只注射1.5mL的生理鹽水。免疫7d、30d、60d、180d后分別對第1至4組用致死量禽霍亂和大腸桿菌菌液攻毒，測定免疫效力。對1至4組攻毒同時每次分別取對照組2只雞進行功毒。試驗雞攻毒后連續觀察7d，記錄各組發病、死亡情況^[5]。

3 結果與分析

3.1 結果。

3.1.1 疫苗的物理性狀觀察。

3.1.1.1 劑型：乳黃色或黃褐色均勻乳狀混懸液久置底部有沉淀，充分搖勻后成均勻乳狀混懸液。

3.1.2.2 粘度：檢驗前將疫苗置室溫數小時，然后充分搖勻，以24℃下經垂直放置的10mL血清吸管放出0.4mL蜂膠疫苗所需時間秒(s)表示平均流出時間不超過4S。

3.1.2 疫苗的安全性試驗。免疫后較安靜，個別雞免疫后喜臥、嗜眠，一般于2-4 h自行恢復正常，全身無不良反應，注射局部無腫脹、無疼痛、無壞死與對照組無明顯差異。

3.1.3 疫苗的免疫效力測定。

3.1.3.1 疫苗對小鼠免疫效力測定結果（表1）

表1 疫苗對小鼠免疫效力測定結果

分組免疫劑量（mL） 攻毒時間(d) 死亡數保護率（%）

1 0.2 7 0100

2 0.2 30 0100

3 0.2 60 190

4 0.2 180 0100

注：對照組攻毒后均死亡

3.1.3.2 疫苗對雞免疫效力測定結果（表2）。

表2 疫苗對雞免疫效力測定結果

分組免疫劑量（mL） 攻毒時間(d) 死亡數保護率（%）

1 1.5 7 197

2 1.5 30 293

3 1.5 60 293

4 1.5 180 386

注：對照組攻毒后均死亡

3.2 分析。

3.2.1 免疫后大部分雞較安靜，個別雞免疫后喜臥、嗜眠，一般于2～4 h自行恢復正常，這可能與蜂膠的麻醉安眠作用有關，這是一種保護性反應，可以減少應激反應的發生。

3.2.2 應用禽霍亂和大腸桿菌病多價二聯蜂膠疫苗對雞免疫后，根據免疫效果跟蹤調查，證明這種疫苗對禽霍亂和禽大腸桿菌病的免疫效果可靠。

3.2.3 試驗結果表明，疫苗安全可靠，無明顯的干擾現象，免疫后7d保護率達97%，30d、60d保護率達93%，180d保護率為86%，疫苗保護期為6個月。

4 討論

4.1 禽霍亂與大腸桿菌病是國內外嚴重危害養禽業發展的兩種常見傳染病，禽霍亂蜂膠滅活疫苗與大腸桿菌病多價蜂膠滅活疫苗均取得較理想的免疫效果，但由于實際應用中，不能同時免疫，常常分別多次免疫注射，費工、費時、費力。本研究在完成單苗研究的基礎上，研制出二聯苗，免疫效果與單苗相同，免疫后7d即可產生堅強保護率。具有降低生產成本，省工、省時、省力，“一針防兩病”的特點。

4.2 制苗工藝中的蜂膠純化工藝簡便易行，方便實用，工藝完善，疫苗的配制工藝較油苗更簡便實用，且可調幅度較大，其工藝成熟，質量穩定。從公共衛生的角度看，我們采用蜂膠滅活疫苗代替常規油苗，是因為用于制備油苗的白油是苯環類化學物質，有致癌的危險，可在動物體內殘留對人體有害。為此，研制新型疫苗是生產和科學發展的迫切需要。另外，在蜂膠疫苗的制備工藝中，蜂膠顆粒的大小和與抗原結合的結構是影響疫苗免疫效果的重要因素之一。由于蜂膠顆粒越小，則同體積的疫苗的表面積就越大，形成的單位顆粒抗原就越多，對機體的免疫系統刺激作用就越強烈而持久。在疫苗的制備中，抗原的制備工藝、純度、濃度和種子的傳代數是影響疫苗免疫效果的重要因素。本研究中，禽巴氏桿菌和大腸桿菌采用液體高密度發酵技術，這樣既保證了抗原的純度、濃度，又保證了疫苗的質量，還降低了疫苗的生產成本。

4.3 由于時間的關系攻毒實驗只進行到6個月，在這6個月中疫苗對雞群的保護率均保持較高水平，由表2中可以看出。所以此二聯疫苗的免疫期至少在6個月。

5 結論

5.1 禽霍亂和雞大腸桿菌病的發病率和死亡率都比較高，同時還能引發其他的并發或繼發癥，對養雞業的危害相當嚴重。由于巴氏桿菌和大腸桿菌易產生耐藥性且耐藥質粒能夠遺傳，而目前又普遍存在抗生素濫用現象，藥物治療的療效不佳，因此研制禽霍亂和大腸桿菌菌苗具有現實意義。從本次試驗的結果可以看出所制疫苗效果較好，在動物攻毒試驗中，保護率較高，因此在實際生產生活中有較高的經濟價值。

5.2 實際生產中巴氏桿菌和大腸桿菌是條件性致病菌，防制該病的關鍵在于加強飼養管理，做好各個環節的衛生消毒，消除各種發病誘因。日常要提供全價優質飼料，并足量補充維生素和電解質，夏季還要注意防暑應添加飼料添加劑，如碳酸氫鈉、桿菌肽鋅、維生素 C等嚴格執行衛生防疫措施，創造一個良好的飼養環境，更有利于疫苗的使用和疫病的預防。

參考文獻

[1] 賈世玉.動物疫苗的研究現狀與發展動向[J].畜禽業，2006.20（5）:16-17

[2] 馮書章.雞大腸桿菌病[J].中國獸醫科技，1989(1):20-22

[3] 楊正時，馬東光，王曉新等.不同血清型大腸桿菌株對藥物的敏感性[J].上海畜牧獸醫通訊，1985(3):16-1

[4] 金天明.肉雞克雷伯氏菌病的病原分離鑒定及其疫苗制備[J].黑龍江畜牧獸醫，2005(12)48-49

[5] 柳春華，韓少禮，呂學章等.從藥敏試驗的結果觀察雞大腸桿菌病的耐藥性[J].黑龍江省畜牧獸醫，1993 (11):25-26