針刺對溶栓治療急性腦梗塞患者D二聚體的影響

孟慶剛　孔慶愛等

孟慶剛孔慶愛唐強高兵兵張寧指導:于致順

(大連大學醫學院,遼寧116622;大連市中醫醫院;黑龍江中醫藥大學附屬二院)

摘要選擇107例急性腦梗塞患者,根據發病時間順序按隨機表將其分為8組。采用D-二聚體為指標,進行治療前后連續性檢測。結果:早期針刺組中D-二聚體的改善程度均優于其它各組(P<0.05),表明頭穴透刺有助于溶栓,尤其是早期溶栓(12 h以內)。針刺在尿激酶對血栓的溶解過程中起到很重要的作用,從某種意義上講,針刺拓寬了"治療時窗",從而為挽救"缺血性半暗帶"創造了有利條件。

主題詞腦梗塞/針灸療法血栓溶栓療法D-二聚體

針刺治療急性腦梗塞療效確鑿。近年來,臨床發現針刺對溶栓治療急性腦梗塞有積極的促進作用。以往的研究資料表明:D-二聚體檢測是一項鑒別原發性纖溶和繼發性纖溶以及監測溶栓治療的有價值的指標。因此,筆者利用自制單克隆抗體,建立酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法檢測血漿D-二聚體含量,觀測針刺對溶栓患者D-二聚體的影響,以進一步證實針刺在促進纖溶過程中的作用。

1一般資料

1.1研究對象

觀察組A自1996年5月～1997年10月選取了107例發病在24 h以內的經CT證實確診為急性腦梗塞(頸內動脈系)住院患者,男67例,女40例;年齡35～75歲,平均53.6歲。按入院先后順序分為發病12 h以內組B1(含12 h)、和大于12 h組B2(含24 h)。然后再將12 h以內組病人隨機分為早期針刺溶栓組(A1B1)13例,早期溶栓組(A2B1)11例,早期常規治療組(A3B1)13例,早期針刺常規治療組(A4B1)12例;同理,將大于12 h B2組病人隨機分為針刺溶栓組(A1B2)16例,溶栓組(A2B2)14例,常規治療組(A3B2)13例,針刺常規治療組(A4B2)15例。擬以溶栓組(A2)、常規治療組(A3)、針刺常規治療組(A4)為針刺溶栓組(A1)的對照組。以上各組病人,均由神經內科醫師根據臨床評分、CT、病理和實驗室檢查結果診斷,符合有關診斷標準。

對照組C正常組C1(40例),健康中青年男女各半;年齡20～50歲,平均43歲。均為醫院健康獻血員。老年人組C2(20例),健康老年人男12例,女8例;年齡51～75歲,平均57.7歲。均經體檢排除高血壓、冠心病、高血脂、糖尿病,無煙、酒嗜好,近2周內無服藥史。

1.2觀測指標D-二聚體單抗的制備

純化抗原:在200 mg純纖維蛋白原(Fg)中,分別加入5 mmol/L的CaCl2,50 U的純凝血酶,4 mg的因子XⅡ,0.15 mol/L的NaCl,0.1 mol/L Tris,使pH=7.4于37 ℃溫育18 h后,再分別加入1.2 mg純纖溶酶,500 U的尿激酶,靜置18 h后,用0.01 mol/L的Tris緩沖液透析,pH=8.6。然后用DEAE-52層析,SDS電泳分析,將D-二聚體部分合并。用PEG透析濃縮后再次分離,得到純度較高的D-二聚體作為抗原。

單抗制備:選用8周齡雄性BALB/C小鼠,用福氏完全佐劑加20 μg D-二聚體純抗原,常規腹腔注射,免疫2次,間隔4、8周,再用20 μg D-二聚體抗原加強免疫,4天后殺死小鼠,取脾做細胞融合,2周后待細胞克隆長到約為培養孔的1/8時,用抗原進行篩選,得到8個特異性D-二聚體單抗株。

1.3研究方法

(1)ELISA法的建立

采用雙抗體夾心法。用1株自制D-二聚體單抗,包被于聚丙乙烯塑料板,另1株單抗標記辣根過氧化物酶,經交叉配對試驗,找到2株能夠用于D-二聚體的捕捉法測定,此即ELISA雙抗體夾心法。

(2)D-二聚體檢測方法

血漿準備:取患者靜脈血,用0.13 mol/L檬酸鈉1∶9抗凝,3000 r/min,低溫離心,分離血漿,于-20 ℃下保存待檢。

檢測方法:在包被單抗的酶標反應板上,加入待檢樣品和不同稀釋度的標準品,37 ℃溫育1 h后,洗4次,再加入酶標記的單抗,37 ℃溫育30 min后,洗4次,再加OPD底物顯色,37 ℃溫育15 min,加2 mol/L硫酸中止反應。最后在492 nm波長下比色,根據曲線求得D-二聚體含量,單位是mg/L血漿。

(3)治療方法

針刺溶栓組A1:包含B1、B2兩組,入院后即針刺同時檢測指標,然后再靜脈溶栓。

溶栓方法:采用南京大學制藥廠生產的尿激酶50～75萬U,加入0.85% NaCl 250 ml,每日1次靜滴,1～1.5 h滴完,連用3天。用藥前常規檢查出凝血時間、血小板,沒有出血傾向時可用。同時口服維生素C 300 mg,維生素E 100 mg,每日3次;用藥第2天給腸溶阿斯匹林40 mg,每日1次口服。3天后用精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml每日1次,靜滴1周,然后改用改善腦代謝藥物如ATP40 mg、輔酶A 100 U、胞二磷膽堿0.75 g,每日1次,連用10天。腦水腫嚴重者給20%甘露醇250 ml,每日2～4次靜滴。

針刺取穴:前神聰透懸厘穴(病灶側),百會透曲鬢穴(雙側)。

針刺方法:常規消毒后,用0.40 mm×50 mm毫針,按上述穴區分3段透刺,針體與皮膚呈15度角,至帽狀腱膜下,深約40 mm。針后捻轉200次/min,每根針捻轉2 min,留針8 h。其間,開始每隔30 min捻轉1次,重復2次,然后每2 h捻轉1次,直至出針。每日1次,10次為一療程。

溶栓治療組A2:包括B1、B2兩組,入院后先檢測指標,然后開始靜脈溶栓(方法同A1組)。

常規治療組A3:包括B1、B2兩組,入院后先檢測指標,然后開始常規治療。

口服:維生素C、維生素E、腸溶阿斯匹林,劑量同A1組。靜脈點滴精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml,每日1次,連用10天。然后改用能量合劑(ATP)40 mg、輔酶A 100 U、胞二磷膽堿0.75 g,每日1次,用法同前。重證處理同前。

針刺常規治療對照組A4:包含B1、B2兩組,入院后即針刺(方法同A1組),同時檢測指標,然后進行常規治療(同A3組)。

1.4統計學分析

由于本題采用系統分析方法進行分組,因此,所測各項定量指標均值采用系統方差分析,并進行兩兩組間對比。因需要在不同時間點上測得某指標,以觀察針刺在溶栓灌注各個時間點上的作用,則用具有一個重復測量的多因素方差分析。以上各種分析均用美國SAS公司的數理統計軟件包(6.12版)在686PC機上進行。

2結果

血漿D-二聚體的正常參考值,各家報道不一。本題測值如表1。由此可知,隨著年齡的增高,D-二聚體也逐漸偏高,體內處于相對高凝狀態,這與以往文獻報道一致。觀察組結果見表2～表5。

以上表明:本題所研究的D-二聚體范圍,如表1、表5所示。

治療前、后所有病人的D-二聚體值均高于正常參考值,兩兩相比,差異有非常顯著性意義(P<0.001),而發病在24 h以內未經任何藥物處理的各組D-二聚體均值相比,差異無顯著性意義(P>0.05),見表4,說明B1、B2各組間具有可比性。

針刺溶栓組與溶栓組的D-二聚體在溶栓5 h后,與治療前相比增高非常顯著(P<0.001)。其中,早期針刺溶栓組較早期溶栓組高,針刺溶栓組較溶栓組高(P<0.05)。提示針刺有可能使患者機體早期處于纖溶亢進狀態,從而加速溶栓進程;與此同時,常規治療組與針刺常規治療組的D-二聚體變化與治療前相比,差異無明顯意義(P>0.05)。提示常規藥物不具有纖溶作用,針刺也起不到纖溶作用,機體仍然維持急性期的相對高凝狀態。當第2次用藥后,即T₂時間點上,測定D-二聚體的值,針刺溶栓組(A1B1、A1B2)、溶栓組(A2B1、A2B2)基本維持現狀,且持續到第3天(T₃);此時常規治療組(A3B1、A3B2)、針刺常規治療組(A4B1、A4B2)D-二聚體均值與T₁比較方有上升趨勢(P<0.05)。但與針刺溶栓組、溶栓組相比仍有顯著差異(P<0.05),這種狀態一直持續到1周后(T₄)提示機體有可能處于自溶狀態。當一周后測量D-二聚體時,針刺溶栓組與溶栓組的均值較前次測量結果明顯下降(P<0.05)。第4周測得的結果較前2次雖有明顯差異(P<0.05),且有接近正常參考值趨勢,但與正常參考值比較,差異仍有顯著意義(P<0.01)。常規治療組與針刺常規治療組從第2周起開始下降,與T₃比較差異有顯著性意義(P<0.05),4周后測量仍呈下降趨勢,與T₄比較P值小于0.05。

3討論

D-二聚體(D-dimer)是纖維蛋白單體(fibrin monomer)經活化因子ⅩⅢ(F ⅩⅢa)交聯后,再經纖溶酶(Plasmin)水解所產生的一種特異降解產物。利用Latex和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法,可以分別定性和定量測血漿和尿液中D-二聚體的含量。定性陽性或定量增高反映纖溶活性增強和凝血酶生成增多,是一項鑒別原發性纖溶和繼發性纖溶以及監測溶栓治療的較有價值的指標。在凝血過程中,凝血酶水解纖維蛋白原先后釋放出纖維蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB),剩余部分為可溶性纖維蛋白單體(SFM),在因子ⅩⅢa作用下,SFM轉變為纖維蛋白,從而血液凝固。此過程是因子ⅩⅢa(轉谷酰胺酶)在谷氨酸(397)與賴氨酸(405)處形成ε-(γ-谷氨酸-賴氨酸)交聯。這種交聯首先發生于兩條端與端聚合的纖維蛋白單體的γ鏈之間,其次發生于α鏈和α鏈之間,然后才發生在γ-α鏈之間。通過上述交聯后所形成的纖維蛋白很穩定,一般不再溶解。纖溶酶除了可以降解纖維蛋白原和SFM外,也可降解交聯的纖維蛋白。交聯纖維蛋白在纖溶酶的降解過程中,逐漸生成X′、Y′、D和E′碎片以及DD、DD/E、YD/DY和YY/DD等多聚體,其中最簡單的降解產物是D-二聚體和DD/E復合體。血漿D-二聚體作為交聯纖維蛋白的特異降解產物,其水平的增高反映繼發性纖溶活性的增強,可作為體內高凝狀態和纖溶亢進的分子標志物之一。因此,它對高凝狀態和血栓性疾病的診斷、療效觀察和預后判斷有重要意義。

血漿D-二聚體作為交聯纖維蛋白的特異降解產物,其水平的增高與否,直接反映著繼發纖溶活性的狀況,是體內高凝狀態和纖溶亢進的特異性指標之一。

以往的實驗提示,D-二聚體在應用藥物后,一般5 h方達到高峰。選擇治療后5 h為觀測點。

血漿D-二聚體的水平在腦血管疾病時變化不一。Greenberg等報道,在急性缺血性中風發病1周內,血漿D-二聚體水平略有升高,2周后則持續增高。Ono等人發現,血漿D-二聚體的水平與年齡有關,大于75歲(含75歲)的中風患者與正常對照組比較差異顯著,而低年齡組中風患者則差異不明顯。本題測定107例腦血管疾病患者的血漿D-二聚體水平,較正常對照組有明顯升高(P<0.001)。然而,無論腦梗塞的急性期還是恢復期,均較正常對照組差異有顯著意義(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.001)。并且腦梗塞的急性期和恢復期均較健康老年人組明顯升高(P<0.001),這與文獻報道基本一致。

4結論

(1)本題之所以選擇D-二聚體作為溶栓的特異性指標是因為尿激酶能激活纖溶酶原,使纖溶酶原轉化成纖維蛋白溶解酶,后者可使交聯纖維蛋白降解,產生纖維蛋白降解產物(FDP),從而溶解血栓。然而,纖維蛋白溶解酶除了使纖維蛋白降解外,還可使纖維蛋白原降解產生FDP,故此FDP升高并不一定表示有血栓的形成或溶解。交聯纖維蛋白特異性降解產物D-二聚體的檢測為血栓形成及溶栓療效的判斷解決了難題。從本題檢測結果可知D-二聚體含量的多少對針刺加溶栓療效的判定有重要意義。

(2)本題研究還表明:早期溶栓+針刺組中各項指標的改善程度均優于本題中其它各組(P<0.05),其后依次早期溶栓組、針刺溶栓組、溶栓組(P<0.05),其中針刺溶栓組近期測值與溶栓組相比,差異無顯著性(P>0.05)。但遠期觀測,針刺溶栓組中各項指標的改善程度高于溶栓組(P<0.05),表明頭穴透刺有助于溶栓,尤其是早期溶栓(12 h以內)。針刺在尿激酶對血栓的溶解過程中起到很重要的作用,從某種意義上講,針刺拓寬了"治療時窗",從而為挽救"缺血性半暗帶"創造了有利條件;但針刺對"治療時窗"的拓寬也是有限制的,超過這一時限(12～24 h),針刺的這種作用則不甚明顯。另外,早期針刺組、針刺組、早期常規治療組、常規治療組中各項指標的改善程度遠不如溶栓療法的同一時間組(P<0.05)。結果同樣表明:早治療比晚治療效果顯著,針刺與常規治療配合發揮了一定的作用,但遠不如與溶栓療法配合時作用明顯(P<0.05)。