抗菌肽對預(yù)防肉雞壞死性腸炎的作用研究

張 琳， 張 江，熊海濤，關(guān)靜姝

（ 1.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，林州 456550；2.國家飼料工程技術(shù)研究中心，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100085）

近年來，全世界主要養(yǎng)禽國家和地區(qū)都普遍存在產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌[1]。從全球范圍來看，禽類養(yǎng)殖場梭菌疾病的發(fā)生率相當(dāng)高，而在亞洲發(fā)生率更高。產(chǎn)氣莢膜梭菌是典型的致病菌，有5種類型，即A、B、C、D、E型，能分泌包括α毒素及β毒素在內(nèi)的12種外毒素對機(jī)體造成破壞。梭菌感染共分為以下幾種類型：亞臨床型梭菌感染、臨床型梭菌感染和混合型梭菌感染。亞臨床梭菌感染典型特征：糞樣梭菌活菌計(jì)數(shù)＞104cfu·g-1，沒有明顯的表觀癥狀，但是可以抑制生長性能及增加飼料損耗，但由于往往受到忽視，其損失持久巨大。研究表明，與健康雞相比，亞臨床壞死性腸炎（隱性梭菌感染）雞體重會降低12%；料肉比會升高10.9%[2]。臨床型的梭菌感染典型特征：糞樣梭菌活菌計(jì)數(shù)＞106cfu·g-1，造成家禽的水便、壞死性腸炎等典型癥狀。混合型梭菌感染典型特征：與球蟲的混合感染，腸道組織損傷是引發(fā)梭菌感染的有利條件，而腸道寄生蟲特別是球蟲，其對腸道上皮組織的破壞，往往引起梭菌的繼發(fā)感染，造成梭菌-球蟲循環(huán)惡化的級聯(lián)反應(yīng)[3]。

目前針對腸道健康，解決致病梭菌的問題，傳統(tǒng)的方案是依靠抗生素。市場上常見使用的抗生素一般有恩拉霉素、維吉尼亞霉素、阿維拉霉素等。恩拉霉素在目前市場上為國產(chǎn)（山東勝利、浙江海正藥業(yè)）和進(jìn)口恩拉鼎，微生態(tài)制劑有美國建明的克洛生Clostrate粉劑、德固賽GutCare PY1等。總體來說，治療梭菌藥物屬于價格比較高，占用飼料配方較大空間的藥物。目前長時間大量使用抗生素帶來的危害日益凸顯，伴隨著公眾對抗生素應(yīng)用的質(zhì)疑，各國管理愈加嚴(yán)格，法規(guī)也日漸完善。減少抗生素使用，是當(dāng)下畜禽飼料工業(yè)的迫切需要，也是食品安全的迫切需求。

抗菌肽（Antibacterial peptides）是生物體產(chǎn)生的一種先天性帶有正電荷的陽離子多肽，具有先天性免疫作用。由于其獨(dú)特的破膜殺菌機(jī)制，區(qū)別于抗生素，不易產(chǎn)生耐藥性，同時能提高機(jī)體的免疫能力[4]。天蠶素抗菌肽最早由瑞典科學(xué)家Bo?man于1980年用大腸桿菌及陰溝通桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹后發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。

本試驗(yàn)產(chǎn)品梭力克TM是由中農(nóng)穎泰集團(tuán)開發(fā)的新型抗梭菌的抗菌肽——Ⅱ型天蠶素抗菌肽。其在原有天蠶素（命名為Ⅰ型天蠶素抗菌肽）分子的基礎(chǔ)上，對氨基酸序列進(jìn)行定向進(jìn)化，得到的新型分子結(jié)構(gòu)。其方法為通過誘變PCR，隨機(jī)突變天蠶素DNA序列，使其對應(yīng)的氨基酸序列發(fā)生變化，建立突變子文庫，然后采用產(chǎn)氣莢膜梭菌為指示菌進(jìn)行高通量篩選，獲得一種新型天蠶素，命名為Ⅱ型天蠶素抗菌肽。Ⅱ型天蠶素抗菌肽保留原來結(jié)構(gòu)所具有的特點(diǎn)，還增強(qiáng)了對梭菌的殺滅效果。Ⅱ型天蠶素抗菌肽第28個氨酸由原分子的苯丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，并且由疏水性氨基酸變?yōu)橛H水性氨基酸，改變了分子的極性，從而增強(qiáng)了其殺菌能力。梭力克的主要成分Ⅱ型天蠶素由37個氨基酸組成。通過生化和核磁共振的方法，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中含有兩個α-螺旋和一個連接環(huán)。構(gòu)成兩個α-螺旋的分別是第6～16氨基酸殘基和第26～35氨基酸殘基，連接環(huán)為第17氨基酸～25氨基酸殘基。其中，環(huán)狀區(qū)域通過疏水作用力和氫鍵維持。

目前認(rèn)為，梭力克通過以下方式抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌：通過抑制細(xì)菌的能量代謝而抑制了細(xì)菌的分裂；通過抑制NF-kb，提高CD4/CD8，促進(jìn)sIgA來抑制梭菌；通過改變細(xì)胞膜的通透性，從而使細(xì)菌細(xì)胞膜破碎，內(nèi)容物外滲，病原細(xì)菌死亡。

體外抑菌試驗(yàn)研究表明，Ⅱ型天蠶素抗菌肽可有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌，中農(nóng)穎泰公司也成功將其進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此抗菌肽對肉雞壞死性腸炎的作用效果研究將會極大推動其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇發(fā)育正常的1日齡AA肉仔雞400只，隨機(jī)分為4組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，各組間雞只平均始重差異不顯著（P＞0.05）。分別為對照組（基礎(chǔ)日糧），低劑量梭力克組（基礎(chǔ)日糧+梭力克100 g·t-1）、高劑量梭力克組（基礎(chǔ)日糧+梭力克200 g·t-1）、恩拉霉素組（基礎(chǔ)日糧+4%恩拉霉素250 g）。

1.2 試驗(yàn)日糧與飼養(yǎng)管理

肉雞按日齡分為0～21日齡和22～42日齡兩個階段飼養(yǎng)，對照組和各處理組基礎(chǔ)日糧與營養(yǎng)水平相同。肉雞基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。天蠶素抗菌肽——梭力克產(chǎn)品由中農(nóng)穎泰集團(tuán)提供。試驗(yàn)在南口試驗(yàn)基地進(jìn)行，采用封閉式雞舍3層籠養(yǎng)，室內(nèi)溫度按照AA肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)控制。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，按照正常防疫程序適時接種雞新城疫疫苗、傳染性法氏囊疫苗。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生產(chǎn)性能指標(biāo)測定

試驗(yàn)期間觀察雞只的健康狀態(tài)，計(jì)算死淘率。分別于試驗(yàn)43 d早晨喂料前，對每個重復(fù)的雞進(jìn)行空腹稱重。記錄全期1～42日齡兩個階段的平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量

于試驗(yàn)期21和42 d，每個重復(fù)采集當(dāng)天新鮮糞便6份，每份約5 g，將每份糞樣混合用于檢測糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸桿菌及總耗氧菌的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行Duncan's多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 天蠶素抗菌肽對肉雞生產(chǎn)性能的影響

天蠶素抗菌肽對肉雞生產(chǎn)性能的影響見表2。

在整個試驗(yàn)期間，觀察肉雞糞便形態(tài)，各處理組糞便成形度優(yōu)于對照組，且梭力克200 g試驗(yàn)組效果最佳。肉雞全期的生產(chǎn)性能如表2所示，與對照組相比，恩拉霉素組、梭力克100 g組以及梭力克200 g組的肉雞末重和日增重顯著提高，料肉比顯著降低（P＜0.05），且梭力克組較恩拉霉素組生產(chǎn)性能有所提高。各組之間日采食量無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平 %

表2 天蠶素抗菌肽對肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 天蠶素抗菌肽對糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響

于42 d搜集各處理組肉雞新鮮糞便，平板計(jì)數(shù)法測定糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。結(jié)果見表3。

由表3可知，與對照組相比，恩拉霉素組、100 g梭力克組以及200 g梭力克組糞便中梭菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；200 g梭力克組梭菌減少比例高達(dá)95.75%。

表3 天蠶素抗菌肽對糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響

3 討論

目前，細(xì)菌對傳統(tǒng)抗生素的耐藥性問題已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，因此研究人員開始積極尋找不易產(chǎn)生耐藥菌株且效果較好的新型抗菌劑。截止到目前，發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已有兩千多種，其中包括動物、植物、真菌等產(chǎn)生的抗菌肽[5]。根據(jù)氨基酸組成、來源和結(jié)構(gòu)特征，可將抗菌肽分為6大類：線性螺旋肽；富含包括堿性氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基為特征的陽離子抗菌肽，多數(shù)呈α-螺旋結(jié)構(gòu)；含有一個二硫鍵的環(huán)鏈結(jié)構(gòu)抗菌肽；含有兩個或更多二硫鍵，具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽；來源于大蛋白的抗菌肽；由已知功能的多肽衍生而來的具有抗菌活性的肽。天蠶素抗菌肽屬于線性螺旋肽，根據(jù)Ceropin A和D設(shè)計(jì)合成的含37個氨基酸殘基的雜合肽，以枯草芽孢桿菌為工程菌成功表達(dá)的基因工程產(chǎn)物[6]。

本試驗(yàn)研究表明，經(jīng)過分子定向進(jìn)化技術(shù)改造天蠶素抗菌肽分子結(jié)構(gòu)，獲得的Ⅱ型天蠶素抗菌肽，其對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較好的抑制作用。目前認(rèn)為，梭力克通過以下方式抑制梭菌：通過抑制細(xì)菌的能量代謝而抑制細(xì)菌的分裂，細(xì)菌的分裂過程是一個耗能的過程，細(xì)菌分裂時細(xì)菌的中部向內(nèi)凹陷，一分為二形成兩個細(xì)胞。其向內(nèi)凹陷的原動力來源于GTP水解，GTP與FtsZ蛋白的結(jié)合被認(rèn)為是產(chǎn)生細(xì)菌分裂原始動力最重要的一步。梭力克可調(diào)節(jié)3個關(guān)于能量代謝的蛋白表達(dá)：D-乳酸脫氫酶、丙酮酸轉(zhuǎn)醛酶和磷酸烯酮丙酮酸羧激酶。減少細(xì)菌產(chǎn)生的ATP勢必導(dǎo)致由GDP轉(zhuǎn)化為GTP的量減少，使細(xì)菌不能完成分裂。通過抑制NF-kb，提高CD4/CD8，促進(jìn)sIgA來抑制梭菌。通過改變細(xì)胞膜的通透性，從而使細(xì)菌細(xì)胞膜破碎，內(nèi)容物外滲，病原細(xì)菌死亡，是抗菌肽普遍的殺菌機(jī)制。

本試驗(yàn)肉雞養(yǎng)殖結(jié)束，收集肉雞糞便，檢測糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)各處理組糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均顯著低于對照組，其中梭力克組顯著降低高達(dá)95.75%。隨著歐美等發(fā)達(dá)國家抗生素的禁用，產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎發(fā)病率普遍增高，尤其在潮濕的陰雨季節(jié)更易發(fā)生。該病不僅使動物生產(chǎn)性能降低、雞群的死亡率也大幅增高，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在肉雞的生產(chǎn)性能方面，各處理組表現(xiàn)也均優(yōu)于對照組，其中200 g梭力克組料重比相對于對照組顯著降低，大幅提高養(yǎng)殖效益。

4 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，在肉雞的生產(chǎn)性能方面，各處理組表現(xiàn)也均優(yōu)于對照組，其中200 g梭力克組料重比相對于對照組顯著降低（P＜0.05），大幅提高肉雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

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