三羥基異黃酮誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡及其機制研究

[摘要]目的：探討三羥基異黃酮(Geni stein)誘導體外培養的人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的作用及相關機制。方法：體外分離培養人增生性瘢痕成纖維細胞，不同濃度Geni stein作用后，MTT比色法檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，We stern Blot法檢測細胞Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表達。結果：在6eni stein作用下，增生性瘢痕成纖維細胞的生長受到抑制；細胞凋亡率增加，與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)；Bcl－2的表達下調、Bax、Caspase－3表達增加。結論：Geni stein可通過誘導凋亡抑制增生性瘢痕成纖維細胞增殖，其作用機制可能與影響Bcl－2、Bax、Caspa se－3等凋亡調控基因的表達有關。

[關鍵詞]三羥基異黃酮；增生性瘢痕：凋亡；Bcl－2；Bax；Caspase－3

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]l008－6455(2007)05－0600－03

對增生性瘢痕(hyperplastic scar，Hs)防治的研究仍是醫學界的難題，目前尚未找到理想的治療約物。研究表明，成纖維細胞的增殖與凋亡之間的失衡與病理性瘢痕的形成具有密切關系，通過對成纖維細胞凋亡的誘導可有效抑制瘢痕增生從而達到治療瘢痕的作用。5，7，4’一三羥基異黃酮(Genistein)是來源可豆類的植物雌激素類化合物，研究表明其對多種惡性腫瘤細胞具有誘導凋亡、抑制生長的作用，對組織器官纖維化也有一定的治療效果。本實驗研究Genistein對體外培養人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的作用并探討其可能機制，為臨床應用Genistein治療病理性瘢痕提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要儀器：YJ－875型超凈上作臺(蘇州凈化設備公司)、1815TC型二氧化碳培養箱(美國SHEL－LAB)、550型酶標儀(美國BIO－RAD)、FACS Caliber流式細胞儀(美國Bencton Dickinson)、Mini－PROTEAN型電泳槽(美國Bio－Rad)、Gel Doc2000型凝膠成像系統(美國Bio－Rad)。

1.2 主要試劑：5，7，4’一三羥基異黃酮(Sigma，美國)、DMEM細胞培養基(Hyclone，美國)、四甲基偶氮唑藍(rrT)(Sigma，美國)、碘化丙啶(PI)(sigma，美國)、小鼠人Bcl－2單克隆抗體(Santa Cruz，美國)、小鼠抗人Bax單克隆抗體(Santa Cruz，美國)、小鼠抗人Caspase－3單克隆抗體(santaCruz，美國)、Western blotting檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 細胞培養和分組處理：采用組織塊法行瘢痕成纖維細胞原代培養(增生性瘢痕組織來源于本院6例深II度燒傷后5～8月瘢痕患者手術所取標本，瘢痕外觀充血發紅、質硬，高于皮面1cm以上，處于增生活躍期；局部無感染和潰瘍；未使用過激素類藥物、抗腫瘤藥物以及未曾接受放射治療者)，培養體系為DMEM培養液(含體積分數10％的新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素)。將瘢痕切成1mm³大小組織塊置于培養瓶中，在5％CO₂、37℃、飽和濕度條件下培養6～8h，待組織塊貼壁后加入DMEM培養基繼續培養；原代細胞生長成單層后，每4～5天分種傳代1次，實驗用第3～5代細胞。將處于對數生長期的細胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液接種于96孔平面培養板中，調整細胞數為2.5×10⁴/ml，每孔細胞懸液200ul。實驗組分別加入DMSO配制終濃度為25umol/L、50umol/L、100umol/L的Geni stein；對照組只加同體積的DMSO；各組設3個復孔，繼續培養48h。

1.4 MTT法檢測細胞增殖：分別于每孔加入0.5％MTT溶液20ul，37℃繼續培養4h，小心吸棄上清，每孔加入150ul DMSO震蕩15min，振蕩待紫藍色結晶完全溶解，以酶標儀在490nm波長檢測各孔的光密度值(OD值)。

1.5 流式細胞分析測定細胞凋亡：用PBS沖洗細胞，0.25％胰蛋白酶消化分離細胞，調整細胞濃度為1×10⁵/ml，70％冷乙醇固定，PBS離心洗滌三次，加入lml PBS及RNA酶A5ul，37℃作用30min，加入碘化丙啶(PI)在4℃染色30min，進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.6 Western Blot蛋白免疫印跡法測定細胞Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表達：常規收集各組細胞，加入預冷的NP－40細胞裂解液冰上靜置30min裂解細胞，4℃振蕩離心，收集上清，Lowry法測定蛋白含量。加適量上樣緩沖液100℃熱變性5min，取100ug總蛋白在10％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳；再將凝膠中的蛋白質低溫電轉移至硝酸纖維素膜；按Western blotting試劑盒操作步驟分別加入一抗及FITC－TgG二抗講行反應(內參照為β－actin蛋白)，用熒光成像分析系統采集蛋白電泳條帶，Quangtity One軟件分析計算得到蛋白表達指數EI。EI＝(目的蛋白條帶面積×灰度)／(內參照蛋白條帶面積×灰度)

1.7 統計學處理：采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以x±s表示，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1細胞增殖：各組Genistein處理后細胞的增殖均受到抑制，與對照組相比有顯著性差異(P＜O.05)，隨濃度的升高，抑制率增加，呈劑量一效應關系。100umol/L Genistein對細胞增殖的抑制作用與對照相比具有非常顯著性的差異(P＜0.01)(表1)。

2.3 Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表達：樣品蛋白經電泳后得到相應大小片段的產物，在顯像系統下可見相應表達帶(圖1)，經內參標準化后得到各組蛋白表達指數(表3)。結果顯示在Genistein作用下，Bcl－2蛋向的表達隨6enistein濃度增加而減弱，而Bax及Caspase－3的表達逐漸增強，與對照相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

細胞凋亡(apoptosis)是一種多基因調控的程序性死亡過程，它是調控機體生長發育、維護內環境平衡的一種重要的自我調節機制。病理性瘢痕的發生與瘢痕成纖維細胞的異常增殖與凋亡不足有密切關系，促進細胞凋亡是治療增生性瘢痕的有效手段。

細胞凋亡受多種凋亡相關基因編碼的蛋白調控，是多種促進因素和抑制因素共同作用的結果。凋亡調控基因包含兩類功能相反的基因，一類是抑制細胞凋亡的基因如Bcl－2，另一類為包含Bax、Caspase等在內的促細胞凋亡基岡。目前認為Bcl－2與Bax基因及其蛋白產物是最重要的凋亡調控因子，其比例的變化在誘發細胞凋亡的過程中具有中心性作用。Wassermann等的研究表明增生性瘢痕組織中Bcl－2蛋白的含量較正常皮膚升高，而Bax含量顯著降低，說明瘢痕組織中凋亡抑制蛋白高表達而凋亡促進蛋白低表達或不表達，其引起的細胞凋廣：受阻可能是增生性瘢痕形成的原因之一。Caspase－3是細胞另一重要的凋亡調控分了，也是細胞凋亡的重要標志，大量研究表明細胞凋亡過程是一個復雜的、由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程。在一些外界刺激因素的作用下，Caspases－3活化，使一些處于靜止狀態的促凋亡因子被激活(如Caspase－6和PKCδ等)，而另外一些凋亡抑制因子(如Bcl－2)被滅活；部分維持細胞結構的物質(如肌動蛋白，核纖層蛋白等)被降解；一些與DNA損傷修復、RNA剪切、DNA轉錄相關的蛋白因子被裂解失活，細胞發生凋亡水解。增生性瘢痕組織中Caspase－3蛋白的陽性細胞率明顯低于正常皮膚組織，因此其介導的細胞凋亡也可能因此隨之降低，凋亡和增殖間的平衡被打破，最終引起肉芽組織過度增生，形成增生性瘢痕，說明Caspase－3參與了增生性瘢痕形成的調控。

Genistein是大豆異黃酮的主要成分，是一種特異性酪氨酸蛋白激酶抑制劑，能特異性阻斷受體酪氨酸蛋白激酶及整合素等信號分子介導的蛋白酪氨酸激酶磷酸化，從而影響細胞的增殖和分化，可誘導腫瘤細胞凋亡而產生抑制作用。本研究檢測Genistein對增生性瘢痕成纖維細胞增殖、凋亡及Bcl－2、Bax，Caspase－3的表達變化的影響，發現Genistein能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細胞增殖，增加細胞凋亡率，進一步研究結果發現Bcl－2的表達隨Genistein作用濃度增高而下降，而Bax，Caspase－3含量逐漸上升，與對照相比具有顯著性差異。實驗證實Genistein可通過誘導凋亡而產生對瘢痕細胞增殖的抑制，其凋亡的發生可能與影響Bcl－2、Bax、Caspase－3等凋亡調控基因的表達有關。Genistein作為一種抑制腫瘤增殖及組織纖維化的藥物具有廣闊的應用前景，但對其信號調節作用的具體過程和控制凋亡與增殖的機制還有待進一步的研究。

編輯 張惠娟