禽類早期性別鑒定研究進展

摘要：從種蛋外型、胚線形態、性腺形態、分子水平、激素水平等方面對禽類早期性別鑒定進行概迷，并就其研究進行展望。

關鍵詞：禽；早期性別鑒定；研究進展

中圖分類號：S814.7 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X(2008)05-0016-03

禽類性別的早期鑒定對禽類飼養管理、繁殖育種、遺傳疾病防治、種群結構和群體遺傳分析等都具有非常重要的意義。在生產實踐中，尤其是在種蛋的孵化階段，這項技術能夠節省大量的人力、物力資源，提高養禽經濟效益。但就禽類而言。要在受精前就確定其性別一般認為是不可能的，這主要是由于禽類的精于僅為Z型配子。在成熟卵泡排卵前1～4h，卵母細胞才通過減數分裂成為含W染色體或Z染色體的配子。因此，只有卵子或晚期胚胎才可能提供有關于性別遺傳的信息。筆者將就禽類早期的性別鑒定研究作一概述，試圖通過這些技術的比較，找到一條快速、準確的性別鑒定途徑。

1 禽類早期性別鑒定方法

1.1 種蛋外型鑒別法

高際生在1987年發現，隨著蛋型指數的增長，公雛比例逐漸增大，母雛比例相應略減；蛋重在64g以下者公雛比例稍大，以上者母雛比例略高；種蛋比重與性別之間沒有明顯的規律性關系；蛋殼細致度與性別關系不明顯。呂志南等用模糊模式進行蛋重、蛋型指數以及蛋殼致密度的綜合來判定種蛋性別，其實際預報的正確率在93％以上。而彭秀麗等用單因子試驗設計，探討了羅曼父母代種蛋蛋形指數與孵化率、性比例的關系，結果表明，蛋形指數為72％～77％時孵化率最高。蛋形指數與性比例無直接關系，符合遺傳規律1:1的性比例關系。但這些試驗重復率較低，所以盛建華等認為，蛋型指數和其性別無關。

1.2 胚線形態鑒別法

唐劍林等10在種蛋入孵3d后照蛋，發現雄胚主血管明顯，血管較粗，分布均勻；雌胚血管纖細，粗細均勻，分支較多，呈不規則狀(見圖1)。18d二照后結果表明，雞胚在孵化3d時最易鑒別。準確率雌胚為89.2％，雄胚為88.5％。李振綱等采用自己研究的方法對291個雞胚蛋進行了判別，挑出雄性胚蛋117個，把判別后的胚蛋繼續孵化，待雛雞出殼后，觀看泄殖腔進行驗證，結果正確率為84％。李振剛等還從雞胚蛋血線與性別關系出發，對孵化72h的雞蛋血線進行數據統計，建立了判定雞胚性別的線性方程，其判定準確率達到84.1％。

1.3 性腺形態鑒定法

一般認為，性別決定出現在胚胎發育5d左右，在此前發育的性腺處于未分化階段，即在雌雄間沒有差別。從雞胚來看，其生殖脊出現在3.5d左右，而在5.5d才出現性腺分化，到7.5d或8d才可通過形態學方法檢查作出可靠的性別鑒定。所以在胚胎發育到第8天，睪丸和卵巢已經可以通過形態進行區別。雌性中的右側卵巢退化，導致卵巢兩側發育不平衡，這種現象可以在低倍放大鏡下觀察到；而在雄性，兩側睪丸對稱發育。這也是從形態上鑒別雌雄的一個較好的方法。

1.4 分子水平的鑒定

分子鑒定方法由于取樣少、準確度高，近年來得到充分發展。

1.4.1 DNA含量鑒別法 禽類由于Z和W兩種染色體上DNA含量不同而使性細胞中DNA含量相差約2.0％(公雞基因組的DNA含量通常比母雞高2.0％左右)。并且禽的種類不同，雌雄性DNA的含量存在差異，一般在0.6％～3.5％。可利用碘化丙錠對雌雄性細胞進行染色。再通過流式細胞儀(FCM)檢測細胞DNA含量來確定禽蛋性別。DELHANTY和劉凌云等曾報道了通過染色體核型分析技術進行性別鑒定。

1.4.2 性染色體特異性DNA探針法 利用W染色體DNA的核酸探針與W染色體的DNA進行特異性結合，也是鑒定，禽類性別的一種方法。TONE等通過酶切家禽DNA獲得了W染色體上稱為XhoI家族的0.6Kb和1.1Kb的特異性片段，其中0.6Kb序列拷貝數多達1400個，為家雞所特有。隨后用類似的方法，經EcoRI酶切消化，發現了第3個長為1.2Kb(重復700～4000次)的重復片段。EcoRI家族和兩個Xhol家族構成了W染色體的異染色質區域，是鑒定W染色體的基礎。URYU等對雞W染色體特異的XhoI家族的重復序列進行了克隆和測序，以帶有生物素標記的0.7Kb重復片段的重組質粒為探針，利用兩種雜交技術，對白來航雞進行了性別鑒定。但染色體特異性DNA探針法一般比較費時，操作過程較復雜。

1.4.3 PCR鑒定法 利用PCR技術鑒定性別，靈敏準確。只需微量樣品，就可以確定胚胎的性別。其中最重要的是CHDl基因和ATP5A1基因。由于在w染色體上的一些基因(CHDl基因和ATP5A1基因)或假基因序列(EE0.6序列)是非常保守的，因此可以依此進行性別鑒定。①CHD-W基因鑒定法：CHDI基因全稱為染色體螺旋蛋白基因(Chromo-Helicase-DNA-Binding gene)。是一個定位在鳥類w染色體上的功能性基因，它編碼一個有關調節整個染色體水平上轉錄活性的蛋白。在非平胸鳥類有兩個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖，兩者的外顯子序列和大小相似，內含子大小卻有很大差別。根據這一特性，以內含子兩側保守序列設計特異性引物，利用PCR方法對CHD-W進行擴增，用于多種非平胸目鳥的性別鑒定。利用這種方法GRIFFITHS等曾描述了利用PCR技術鑒定5～7d雞胚性別的方法。HE等利用設計的3對引物對黑天鵝CHD基因進行擴增，經瓊脂糖電泳分析后，雌性有2條帶。而雄性只出現1條帶。胡銳穎等對9種86只國家一級保護鳥類進行了性別鑒定。其準確率高達99％。劉鑄等pq運用CHD基因的一對引物2550F和271成功對東方白鸛(ciconia boyciana)進行了準確簡便的性別鑒定，并對其序列結合其他5種遠源鳥類相應序列進行分析，證實此種方法的科學性和可信性。②ATP5A1基因鑒定法：ATP5A1基因在鳥類W、Z染色體上以不同形式的序列出現，所以將染色體進行酶切并電泳后，通過基因中被稱作PMgl的序列作為探針進行原位雜交。會產生不同條帶，進而區分性別。但此基因的保守性不是很好，在不同鳥類中基因序列有差異，所以在不同物種中需要不同的ATP5A1序列進行鑒定，這增加了性別鑒定的工作量。③鳥類性別鑒定的通用序列鑒定法：除以上介紹的幾種方法外，利用隨機引物擴增來鑒別雌雄的方法在國外也有報道，RAPD方法是最常用的方法。OGAWA等闡述了雞W染色體一個非重復序列的分子特性和細胞學圖譜以及利用它通過PCR廣泛鑒定非平胸鳥類性別的方法。楊光等選擇RAPD方法隨機擴增出了幾種雌性鶴類共有的特異帶。較準確地進行了性別鑒定。李明等還利用朱鸚(nipponia nippon)的近緣種東方白鸛(ciconia boyciana)W性染色體上的性別相關基因PCR引物，成功擴增出朱鸚的性別相關基因，達到了性別鑒定的目的。王利紅等根據已報道的位于家禽w染色體上保守的特異性基因片段對番鴨進行了性別鑒定。俸艷萍等根據W染色體上特異性的0.6kb EcoR I序列和位于Z染色體上的OVR(卵黃生成受體)基因序列設計兩隊引物，利用雙重PCR法鑒定雞的性別。

1.5 激素水平鑒定法

17日齡的雞胚尿囊液中雌激素水平可以通過RIA(放射免疫)試劑進行檢測。在雌胚的尿囊液中，其雌激素含量水平為113～830pg/mL，至少是雄胚含量的3倍。研究表明，雌激素是進行雞胚性別鑒定的理想指標。美國Embrex公司(www，embrex，com)在此方面處于領先地位，已申請兩項專利(專利號分別為6506570和6510811)，前者是測定蛋內尿囊液方法的專利，包括收集、定位尿囊液，使它可以被穩定地取樣。后者是測定性激素水平的專利，如測定禽蛋中雌激素水平升高即表示即將孵出的是母雞。該公司已在進行深入研究并開展商業化試驗，試圖設計出首個測定雞胚尿囊液中雌激素的自動模型。

1.6 其他的鑒定方法

肖天放等對番鴨在孵化期前10d的7個不同溫度進行試驗顯示：不同孵化溫度下出殼的雛番鴨公母性別存在明顯的差異，公雛率隨孵化溫度的升高而升高，母雛率隨孵化溫度的升高而下降。雛番鴨第二性比(♂:♀)與孵化前期溫度間的相關系數為0.99。王利紅等采用兩種類型的芳香化酶抑制劑處理孵化7d的番鴨種蛋，結果顯示，兩種抑制劑均可以在一定程度上誘導番鴨性別雄性化作用，其轉化率分別為87.5％和86.7％，與對照組(46.1％)差異顯著。王光瑛等用3種處理方法對番鴨胚蛋進行處理，結果顯示：芳香化酶抑制劑處理組極顯著提高雄性比例(P＜0.01)。且對種蛋受精率和孵化率無不良影響。

2 禽類早期性別鑒定展望

禽類早期的性別鑒定主要分為蛋殼外鑒定和蛋內容物的鑒定。前者如種蛋外型、胚線形態、性腺形態、溫度、芳香化酶抑制劑等方法。后者如分子方法、激素方法。這些方法的應用均取得了一些較好的成績。例如在對17日齡的雞胚鑒定，中，測定尿囊液中的雌激素顯然已經能使性別在孵化的中期就能得到確認。利用胚胎血線與性比的關系建立方程的方法，這種方法由于鑒別方法較為簡單容易操作，而且鑒別時間較早。不破壞種蛋，不影響孵化。DNA鑒定尤其是CHD-W基因鑒定法，其操作簡便。周期短，大量樣品可以同時檢測，更為重要的是通過雙陽性結果來判斷雌雄，排除了假陰性的可能性，確保了結果的可靠性。然而，這些方法也有缺陷，如種蛋外型、胚線形態等方法其鑒定的準確性有待提高，可能是由于禽的種類、飼養管理及所處環境、處理方法等差異引起。分子方法、激素法都需要采集一定量的測定樣品，盡管通過核磁共振成像技術(MRI)已能較為準確的定位胚盤，但還沒有一種很好的方法可以在打開蛋殼并在不影響后繼孵化的前提下采集樣品。Embrex公司的研究專利盡管解決了性別的鑒定問題，但由于是對孵化17日齡左右的胚蛋進行性別鑒別，其對于更早期的性別鑒定貢獻有限。因此禽類的早期性別鑒定相對于哺乳動物較難。但是，禽類的早期性別鑒定還可以考慮從以下幾個方面進行：①盡管在禽類受精前識別其性別很難實現，但是否可以通過對精于進行某些處理以使其能夠特異性的識別W型配子或通過對母禽進行相關的處理以使其在特定條件下只產生W型配子。②環境條件在一定程度上影響性別的形成。能否通過進一步的研究確定控制性別的準確條件。③早期性別鑒別能否在不打開蛋殼的基礎上(如通過B超)利用其他的方法來實現。