辣椒疫霉菌對甲霜靈的抗性風險研究

摘要：通過對安徽省各地辣椒疫霉菌對甲霜靈抗性進行監測和室內抗性誘導，結果發現：野生辣椒疫霉菌株中敏感、中抗和抗性菌株分別占63.2％、30.4％和6.4％，說明敏感菌株是安徽省辣椒疫霉菌的優勢種群，但EC₂₀測定結果表明安徽的辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性群體水平上已出現不同程度的分化；室內藥劑直接誘變容易獲得抗性突變株，且抗性水平可較其敏感親本高近1000倍，說明辣椒疫霉菌對甲霜靈存在較大的抗藥性風險，據此，討論了相應的抗藥性治理對策。

關鍵詞：辣椒疫霉菌 甲霜靈 抗藥性 治理

疫霉菌是一類重要的植物病原菌，由其引起的植物病害統稱為疫病，常給農業生產帶來重大損失。化學防治是防治疫病的主要方法，甲霜靈(metalaxyl)屬苯基酰胺類殺菌劑。對疫病有特效，但由于該類藥劑屬于特異性位點抑制劑，對病原菌作用位點單一，病菌容易對其產生抗藥性突變。該藥劑于20世紀70年代末首次在歐洲使用，1980年即在愛爾蘭、芬蘭等地檢測到致病疫霉菌(Phytophthora infestans)的抗甲霜靈菌株，此后，由于該藥劑長期大面積使用，疫霉菌對其抗性也越來越重，且抗藥性發生速度快、抗性水平高。國內外均發現辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)在田間對甲霜靈產生了抗性，其中江西省田間的抗性辣椒疫霉菌株占55.6％，吉林省通化地區占78.4％。辣椒疫霉菌株經室內化學誘變易發生抗藥性突變，對甲霜靈產生抗性。以上研究背景提示，甲霜靈用于防治辣椒疫病具有潛在抗藥性風險。但有關田間條件下辣椒疫霉菌對甲霜靈產生抗性的監測和風險鮮見報道。本文報道了安徽省各地辣椒疫霉菌對甲霜靈的抗性監測結果，以期為辣椒疫病防治、辣椒疫霉菌對甲霜靈潛在抗藥性的風險評估和治理提供理論依據。

1、材料與方法

1.1供試菌株

分別從安徽省阜陽、合肥、六安、和縣等16個縣(市、區)多點采集辣椒疫病典型病株，進行室內分離、純化、培養，共獲得辣椒疫病菌株125株，經鑒定均為辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株。以四川邛崍菌株(SCOL)為對照。

1.2供試藥劑

供試藥劑為91.2％甲霜靈原藥，由江蘇寶靈化工公司生產。先用少量丙酮溶解，再用滅菌蒸餾水配成5 mg/mL的母液備用。

1.3培養基

菌株分離選用的是含有100ug/mL氨芐青霉素、50ug/mL利福平和50ug/mL PCNB(五氯硝基苯)的選擇性胡蘿卜培養基(SCA)，菌株保存及試驗對照所用的是胡蘿卜培養基(CA)，測定ECm時選用的是含有甲霜靈不同濃度梯度的胡蘿卜培養基。各種培養基按馬國勝的方法配制。

1.4供試菌株對甲霜靈敏感性及抗性水平測定

1.4.1對甲霜靈敏感性測定采取生長速率法，在CA平板上培養7d的菌落邊緣取直徑5mm的菌絲塊，分別移到含甲霜靈0、5和100ug/L的CA平板中央，置于25℃條件下培養，5d后測定菌落生長量，每處理重復3次。

抗性測定標準：菌株在含5ug/mL甲霜靈CA上的生長量≤在空白CA上生長量的40％的為敏感(MS－Metalaxyl Sensitive)；在含100ug/mL甲霜靈的CA上的生長量≥在空白CA上生長量的40％的為抗性(MR－Metalaxyl Resistant)；在含100ug/mL甲霜靈CA上的生長量<在空白CA上生長量的40％<含5ug/mL甲霜靈CA上的生長量，為中抗(MI－Metalaxyl Intermediate)。

1.4.2抗性水平測定根據1.4.1測定的結果，將抗性和中度抗性菌株分別移到含甲霜靈0、2，5、5、10、20、40、80、160ug/L的CA平板上，敏感菌株分別移到含甲霜靈0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ug/mL的CA平板上。置于25℃條件下培養，5d后測定菌落生長量，每處理重復3次。通過菌絲生長抑制幾率值和甲霜靈的濃度對數之間的線性回歸分析，求出各菌株的EC₅₀值，以敏感菌株SCOL為對照，以抗性菌株的EC₅₀值與敏感菌株的EC₅₀值之比計算各抗性菌株的抗性水平。

1.5供試菌株抗甲霜靈誘變及其抗性水平測定

抗藥性誘變參照高智謀等的方法，將供試菌株在CA平板上25℃下培養5d，再移入含甲霜靈10ug/mL的CA平板上誘變。每培養皿接種4塊大小約10mm×10mm×3mm的菌絲塊，每菌株接種10個培養皿。接種后的培養皿用Parafilm封口。置25℃黑暗中培養。7d后每隔2～3d觀察菌絲塊生長情況，當供試菌株在CA平板上產生快速生長角變區后，再將角變區轉至含10ug/mL的甲霜靈CA平板上，連續轉移3～4次，均能較好生長的菌株即為抗性菌株。抗性水平參照1.4.2的方法。分別測定敏感親本及抗性突變株對甲霜靈的EC₅₀值，并以各自親本為對照。求出各抗性突變株的抗藥性水平。

2、結果與分析

2.1安徽省辣椒疫霉菌對甲霜靈敏感性測定

用Fraser等的方法對2005、2006年采自安徽省內的125個辣椒疫霉菌株對甲霜靈的敏感性進行了測定(表1)。各菌株在含不同濃度甲霜靈的CA平板上菌絲生長率及生長勢相差很大，所有菌株在不含藥的CA上生長良好。但在含甲霜靈5和100ug/mL的平板上，菌絲生長受到不同程度的抑制。從表1可見，供試菌株中對甲霜靈表現為抗性(MR)的有8株。占6.4％；表現為中度抗性(MI)的有38株，占30.4％；表現為敏感(MS)的79株，占63.2％。這說明敏感菌株是安徽辣椒疫霉的優勢種群。進一步測定各菌株的EC₅₀值，結果發現不同來源菌株的ECho存在較大差異：其中來自壽縣的菌株EC₅₀平均值最低，為0.8131ug/mL，分布范圍在0.1896～1.0260ug/mL；和縣菌株的EC₅₀平均值最高，為8.3176ug/mL，分布范圍在0.7715～23.9924ug/mL。可見安徽各地的辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性在群體水平上已表現出不同程度的分化。從樣本采集地甲霜靈的使用情況看，敏感菌株主要來源于沒有或很少使用過甲霜靈的菜地，而中抗或抗性菌株主要采自用藥量較大、甲霜靈使用次數較多的辣椒地。

2.2抗性菌株的抗性水平

通過對供試各菌株的EC₅₀值統計表明。不同來源地的菌株對甲霜靈的敏感性存在顯著差異，其中來自安徽居巢、肥西兩地的菌株全部表現為對甲霜靈敏感，其余地區的菌株則出現不同程度的分化(表1)。以已知野生型敏感菌株SCOL為對照，計算供試8個MR菌株的抗性倍數，結果表明。來自和縣和碭山的抗性菌株所占比例最大、抗性水平最高，其中抗性菌株比例占1/3，最高抗性倍數均在100倍左右(表2)。

2.3辣椒疫霉菌抗甲霜靈誘變及其抗性水平測定

供試敏感菌株在含甲霜靈10ug/mL的CA平板上生長14～21d后，多數菌株能產生快速生長角變區。將各菌株的快速角變區連續轉移至含有同濃度的甲霜靈CA平板時，有部分菌落會繼續產生快速角變區(說明其抗性水平仍在增加)，部分菌株生長緩慢，另有約50％的菌落能較好地生長。連續轉移3—4次后在含10ug/L的CA平板上生長良好的菌株(MRLA－1、MRFN－8和MRQL－3)即為抗甲霜靈菌株。通過測定上述抗性突變株及其親本的EC₅₀值，發現抗性突變株的抗性倍數較高，其中MRLA－1菌株較其敏感親本高出了約954倍。詳見表3。

3、討論與結論

本研究發現，室內誘導易獲得辣椒疫霉菌抗甲霜靈突變株，且抗性水平高，說明辣椒疫霉菌對甲霜靈存在較大的抗性風險；敏感菌株目前仍是安徽辣椒疫霉菌的優勢種群，但安徽各菌株對甲霜靈的敏感程度已出現分化。其中抗性菌株比例、抗性水平較高的菌株主要出現在和縣、碭山等蔬菜基地。抗性菌株的產生可能與甲霜靈的使用頻率和劑量有關，這些地方已連續多年使用，長期多次使用能增加病原菌對藥劑的選擇壓力。從而加速抗性的產生。

目前，在尚無理想的抗病品種的情況下，用藥防治仍是控制植物病害的主要措施，但抗藥性問題已成為生產上的一個突出問題。在抗藥性大面積產生前進行抗藥性風險評估對指導防治具有重要作用。通常，評價植物病原菌對一個殺菌劑的抗藥性風險主要是通過實驗室和田間的誘變或篩選獲得抗藥菌株，再對抗藥菌株進行抗藥水平、抗藥菌株獲得的難易程度及抗藥突變頻率、抗藥性治理的難易等進行綜合評價。本研究表明，雖然敏感菌株依然是安徽省辣椒疫霉菌的優勢種群。但已有36.8％的田間菌株對甲霜靈產生了抗性，抗性倍數最高超過100倍：同時，本試驗證明。在室內用藥劑直接誘變，能較易地獲得抗甲霜靈突變株，且抗性菌株對甲霜靈的抗性可高達其敏感親本的近1000倍，表明甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑的使用存在一定的抗藥風險。

目前防治辣椒疫病的內吸性殺菌劑主要有苯基酰胺類(甲霜靈、惡霜靈、甲呋酰胺、苯霜靈等)、嗎啉類(烯酰嗎啉、氟嗎啉等)、氨基甲酸酯類(霜霉威等)、烷基磷酸鹽類(乙磷鋁等)及乙酰胺類(霜脲氰等)等殺菌劑。由于甲霜靈在內吸性、生物活性和持效期等方面均優于其他苯基酰胺類殺菌劑。因此，作為防治辣椒疫病的有效藥劑之一，棄之不用是不現實的，關鍵是如何降低抗藥性風險、延長其使用年限。有報道表明，甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑間具有交互抗性。霜脲氰與苯基酰胺類間有負交互抗性㈣，但烯酰嗎啉、乙磷鋁、霜脲氰等與苯基酰胺類無交互抗性。根據安徽省辣椒疫霉菌對甲霜靈的抗性水平及分布情況，筆者建議：一方面。要繼續監測辣椒疫霉菌抗藥性的變化。并在抗藥性發生初期及時改變防治策略和用藥方法。特別是有計劃地用上述無交互抗性的多種藥劑進行交替使用，同時要避免使用甲霜靈單劑。并盡量降低其使用頻率和劑量；對抗性頻率較高的地區(如和縣、碭山等地)則最好暫停使用苯基酰胺類殺菌劑，以降低選擇壓力，最大限度地阻止抗藥性發展蔓延。另一方面，要加強肥水管理，注重健身栽培，提高辣椒對疫病的抵抗能力。