西瓜離體再生高效基因型材料的篩選

摘要：為完善西瓜離體再生體系，以23種基因型材料的西瓜無菌苗子葉為試材，運用方差分析篩選高效基因型材料及芽誘導最適培養基。結果表明：基因型不同的材料，誘導效果有明顯差異。篩選的再生高效基因型為魯圓、三白、FW351、PM2和京母。魯圓誘導效果最好，最高誘導率達到90.0％。與18種基因型材料的誘導差異達到了顯著水平；三白、FW351、PM2和京母的誘導效果次之，誘導率分別為85.0％、82.5％、82.5％和80.0％。篩選的芽誘導最適培養基為MS+6－BA3.0mg/L。

關鍵詞：西瓜 組織培養 基因型材料 篩選 方差分析

西瓜(Cirtullus langatus)的遺傳基礎十分狹窄，采用常規育種技術對某些性狀的改良較為困難。基因工程技術為定向改良西瓜新品種提供了一條新的途徑。高效離體再生體系的建立是利用基因工程技術進行西瓜種質資源改良的基礎。西瓜組織培養研究始于20世紀70年代，Andrus首次建立了無籽西瓜的無性繁殖體系。隨后。國內外許多學者也相繼采用頂芽、子葉、花藥和原生質體等進行培養。盡管上述研究取得了一些進展，但國際上依然公認西瓜屬于離體再生較難的作物之一。存在著高效基因型少、再生頻率低、分化芽伸長慢等問題，影響基因工程技術在西瓜遺傳改良中的高效應用。有關西瓜離體再生高效基因型材料的篩選研究還未見報道。本試驗通過對23種基因型材料在不同激素配比的培養基上離體再生率的比較，篩選出再生高效基因型材料，以進一步完善西瓜離體再生技術體系，為西瓜基因工程的改良奠定堅實的技術基礎。

1、材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料由國家蔬菜工程技術研究中心提供。共23份。其中栽培種14份，分別為京母、山趙、T326、魯圓、豐母、303、農母、虎圓、黑圓、白－HC、352、王－M、黃父和三白；野生種9份，分別為PM1、PM2、PI595203、FW351、中信、打籽1、打籽2、野黑和黑崩筋。

1.2試驗方法

1.2.1種子消毒及無苗苗的培養取籽粒飽滿的西瓜種子剝去外殼，用70％的酒精浸泡1min，無菌水沖洗3遍。然后用10％NaClO浸泡10min，無菌水沖洗3遍，接種于MS基本培養基。置于(25±1)℃，黑暗條件下培養。

1.2.2芽誘導培養基采用MS基本培養基，瓊脂0.7％，pH值5.8。根據6－BA和IAA不同濃度組合設置LI－L10共10種培養基(表1)。

1.2.3芽誘導培養方法無菌苗培養4～5d后，選取淡綠色無菌苗子葉接種。先切除子葉上半部分，然后在剩余部分基端和邊緣各切1mm，正面朝上接種于芽誘導培養基上，觀察不同基因型的芽誘導情況。每個處理接種10個子葉塊。重復4次。

1.2.4芽誘導培養條件 采用光照和黑暗2種條件進行芽誘導培養。光照培養：25℃。光周期16h/d，光照度2000lx。黑暗培養：首先在25℃黑暗條件培養6d，然后取出進行光照培養。

1.2.5生根及移栽將2～3cm的莖芽自莖基部切斷，轉入1/2 MS+IAA 0.5mg/L的生根培養基上。試管苗根系長出且粗壯后，煉苗3d，移栽到營養缽中。移栽20d后統計成活率。

1.2.6不定芽誘導率統計方法 子葉接種20d后統計不定芽誘導率。誘導率(％)=分化不定芽的外植體數/接種外植體數x100。方差分析采用DPS軟件。

2、結果與分析

2.1不同西瓜基因型材料和培養條件對不定芽誘導的影響

如表2所示，不同基因型材料的不定芽誘導能力差異較大，變化范圍從0～90.0％。不定芽誘導率較高的基因型有5種，分別是魯圓、三白、PM2、FW351和京母，在最適培養基下獲得的最高不定芽誘導率分別為90.0％(L3)，85.0％(L5)，82.5％(L5)，82.5％(L4)和80.0％(L5)；白－HC在最適的L7培養基上誘導率最高，也只有10％，幾乎不能出芽。而中信的誘導率均為0。說明不同基因型材料不定芽誘導率不同，存在明顯的基因型差異。

同時，對不同基因型材料的不定芽誘導效果進行了方差分析。由于共有10種不同培養基處理，為盡量減少培養基的影響，對每種基因型材料選取誘導效果較好的3種培養基誘導率的平均值進行了方差分析(表3、4)。方差分析結果也表明：由于基因型不同，導致不同材料之間不定芽誘導率差異達到極顯著水平。23種基因型材料中，魯圓與王－M、山趙等18種基因型材料的不定芽誘導率差異達到了顯著水平，與山趙、黃父等17種基因型材料差異達到了極顯著水平。PM2、FW351、三白和京母等4種基因型材料的誘導效果雖然比魯圓差，但差異水平不顯著。PM2和FW35l的平均誘導率同為78.3％，與T32b、野黑等15種基因型材料的誘導率差異顯著：三白不定芽平均誘導率為76.7％。與野黑、打籽2等14種基因型材料的誘導率差異達到了極顯著水平：京母與打籽2、PM1等13種基因型材料的誘導率差異也達到了極顯著水平。王－M、黃父和山趙等8種基因型材料誘導效果居中，平均誘導率達到50.0％～67.5％。黑圓、打籽1和黑崩筋等8種基因型誘導效果較差。平均誘導率都低于50％。白－HC和中信誘導效果最差，與其余21種基因型材料誘導不定芽的差異都達到了極顯著水平。

表2顯示，在最適培養條件上，不同基因型材料也有所差別，京母和山趙等14種基因型材料不定芽誘導的啟動和分化在光下效果最好，豐母和虎圓2種基因型材料不定芽誘導的啟動在暗處效果最好，農母和黑圓等7種基因型在光下和暗處啟動效果相當。

2.2不同培養基對不同西瓜基因型材料不定芽誘導的影響

對不同培養基上23種基因型材料不定芽的誘導結果進行方差分析。方差分析結果如表5。誘導效果最好的培養基是L3，不定芽平均誘導率達到43.8％，與L4等8種培養基的誘導差異達到了極顯著水平；L5培養基誘導效果次之，其不定芽平均誘導率為40.4％，與L4等8種培養基的誘導差異也達到了顯著水平。L3和L5兩種培養基的不定芽誘導效果呈顯著性差異。

不同基因型材料最適誘導培養基不同。魯圓和王－M等9種基因型材料芽誘導率最高的培養基是L3，京母和三白等7種基因型材料芽誘導率最高的培養基是L5。說明基因型與誘導培養基存在互作作用(表2)。

表5還表明，并非激素的質量濃度越高，對西瓜不定芽的誘導越有利。當6－BA濃度為3.0mg/L時，誘導率最高；而當6－BA質量濃度高于3.0mg/L時，誘導率隨質量濃度的升高而降低。當IAA為0mg/L時，誘導率較高；IAA的質量濃度在0.5mg/L時誘導率略降低，說明IAA的增加對不定芽誘導表現出抑制作用。

2.3根誘導和試管苗移栽

材料基因型不同時，其生根能力差別不大。無論何種基因型材料，經過一定的時間。在加入IAA的培養基上都可以誘導其生根。轉入生根培養基的試管苗10d后即可觀察到切口基部有白色不定根生成，20d后根系基本形成，發育成完整試管苗，最高生根率(PM2)可達86.7％。

如果將試管苗直接移栽到營養缽中，成活率較低，平均成活率只有35.0％。本試驗對移栽方法進行了改進。首先將消毒的草炭和蛭石(1：1)分裝到無菌罐頭瓶中，再移入試管苗，然后倒入1/2 MS液體培養基至剛剛浸沒草炭和蛭石，放入培養室培養15d。待試管苗長出新根后，開口煉苗3d，最后附帶罐頭瓶內的草炭和蛭石一起栽入含有無菌基質的營養缽中，比直接移栽成活率明顯提高，平均移栽成活率可達80.0％。

3、討論與結論

許多學者對西瓜離體培養做過研究。利用子葉、頂芽和下胚軸等外植體相繼成功建立了再生體系。由于植物內部激素調節、發育能力及與外源激素的配合等不完全相同，因此，難以用一套高效再生體系來涵蓋全部基因型。筆者選取具有代表性的23種基因型材料進行研究，篩選再生高效基因型材料。通過研究發現。基因型不同，誘導效果具有明顯差異。本試驗中篩選的再生高效基因型材料共5份，其中栽培種3份，分別是魯圓(90.0％)、三白(85.0％)和京母(80.0％)；野生種2份，分別是PM2(82.5％)和FW351(82.5％)。魯圓和京母屬于栽培種的早熟型。三白屬于栽培種的晚熟型，PM2和FW351屬于野生種的晚熟型。這表明基因型材料誘導不定芽的能力與其所屬種類關系不大，主要在于其自身內部的激素調節和發育能力。

在西瓜的離體再生中，6－BA具有至關重要的作用。無論何種基因型只需附加一定質量濃度的6－BA就可以誘導其出芽。但誘導率存在明顯差別。本試驗證實，23種基因型材料平均誘導率在6-BA3.0mg/L時最高，5.0mg/L時次之。當高于3.0mg/L時誘導率出現下降，并且畸形芽、玻璃化芽出現的幾率增加。當6－BA達到9.0mg/L時。玻璃化芽可達到70.0％左右。因此。對西瓜某一基因型材料進行離體培養時，6－BA質量濃度應優先考慮33.0mg/L。

西瓜試管苗直接移栽成活率很低，任春梅等采用無菌嫁接技術移栽。能有效提高成活率。但比較麻煩。本試驗中將試管苗先移入消毒的草炭和蛭石，待其長出新根后再移栽。采用這種延緩試管苗移栽的方法，可以讓試管苗在無菌條件下適應移栽后的生長環境，提高其適應能力，減少根系的損傷，起到煉苗作用，提高其成活率。