Ｋａｎ早期快速篩選轉基因甜瓜的應用研究

摘要：利用Kan處理甜瓜種子、幼苗，選擇不同品種、不同時期Kan臨界濃度。對花粉管通道法轉化的甜瓜種子進行早期篩選。結果表明，魯薄1號甜瓜(薄皮)對Kan反應較烏克蘭、雪里華甜瓜(厚皮)敏感，種子較幼苗敏感，子葉承受的Kan壓力是種子的3～4倍。子葉涂抹法是較適宜的篩選方法。PCR及Southern雜交檢測證明，Kan對大量轉化甜瓜種子進行早期篩選是可行的。

關鍵詞：轉基因甜瓜 Kan 早期篩選 PCR

蔬菜作物轉基因研究已在國內外廣泛開展。研究過程中為了便于選擇轉化植株，通常在構建基因表達載體時插入遺傳標記基因，如Gus、cat、NPT－II、gfp、pat、熒光素酶基因、冠癭堿合成酶基因及二氫葉酸還原酶基因等，其中NPT－II基因應用最為廣泛。使用NPT－II基因轉化植物?？梢允怪参锛毎a生對卡那霉素(Kanamycin，以下簡稱Kan)等抗生素的較大抗性，植株能夠正常生長。

利用花粉管通道法能夠收獲大量“轉化”種子。單純依靠實驗室的分子檢測耗資大、時間長。因此，迫切需要建立一種與花粉管轉化相適應的早期篩選技術。目前。Kan已經應用于轉基因棉花、小麥早期篩選及田間檢測，大量分子證據驗證了Kan檢測的可靠性。由于植物自身對Kan敏感性不同，且同一植物的不同發育時期對Kan抗性也存在差異。因此，研究甜瓜對Kan處理的反應，選擇有效I臨界濃度，可為大量“轉化”種子早期快速篩選提供依據，加快花粉管通道技術在甜瓜基因轉化中的應用。

1、材料與方法

1.1試驗材料

受體甜瓜：烏克蘭(厚皮)、雪里華(網紋)、魯薄1號(薄皮)3個高代低糖自交系及相應的花粉管通道法轉化種子，由山東省農業科學院蔬菜研究所甜瓜課題組提供。供體質粒：攜帶Npt－II、Anti－MAI基因。由山東大學生命科學院趙雙宜、于喜艷教授提供。Kan：硫酸阿米卡星注射液由齊魯制藥廠有限公司生產，產品批號0508171，20萬單位/支。NPT－II引物由上海生工生物工程公司合成。

P₁：5’－GGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGC－3’，P₂：5’－TGCCGACCATCTGTTGTYTGCCC－3’。TaKaRaTaq^TM、λE_coTl4 I購自TaKaRa公司。Southern分析DIG High Primer DNA Labeling and Dectection StarterKit II(Cat No.11585614910)購自Roche DiagnosticsGmbh。Germany。Hybond^TM－N⁺尼龍膜購自AmershanPhamacia公司。其他為常規分析純試劑。

1.2試驗設計

1.2.1試驗濃度種子：Kan質量濃度0～1500 mg/L，每100mg/L設置1個濃度梯度，0mg/L為對照(CK)。葉片：Kan質量濃度0～8000mg/L，每500mg/L設置1個濃度梯度，0mg/L為對照(CK)。

1.2.2處理方法涂抹法：毛筆在Kan液中浸透，均勻涂抹1片子葉、半片真葉正面：連續重復處理3次。浸潤法：脫脂棉團成小球，在Kan液中浸透。擺在葉片正面，為防止棉球滑落，用透明膠固定，3d后拿掉。噴霧法：幼苗2葉1心時用小型噴霧器均勻向苗床噴霧，保證霧流細、勻。連續重復處理3次。

1.2.3調查方法挑選整齊飽滿的普通甜瓜種子，每個材料每個濃度均為100粒。在Kan溶液中浸種，30℃恒溫黑暗條件下催芽。3～4d后統計種子萌發及根系生長情況。田間播種，調查出苗率、綠苗率。

普通種子常規浸種催芽。播種于單孔穴盤，幼苗子葉完全展平及真葉如貳分硬幣大小時，挑選生長一致的幼苗進行Kan處理。連續重復處理3次，每個處理每個重復50株，7 d后調查子葉反應。調查標準參閱祝建波等人的方法。

0級：葉片正常。

1級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色略有差異，但不明顯，葉色仍為綠色。

2級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色對比加深，差異較明顯，葉色變淺。

3級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色差異明顯。葉色由綠轉黃。

4級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色差異極明顯，葉色由黃逐步轉白。

5級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色差異極明顯，葉色由白逐步轉褐，并稍有破損。

6級：葉片處理部位葉色與周邊正常葉色差異極明顯，葉色基本變褐。破損極為嚴重。

1.3轉化種子的篩選

每個品種、每個處理隨機取500?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD化的甜瓜種子，使用Kan臨界濃度處理種子、幼苗，提取Kan⁺綠苗的基因組DNA，進行PCR及Southern雜交檢測。

2、結果與分析

2.1Kan處理方法比較

涂抹法、浸潤法、噴霧法處理甜瓜幼苗，各品種表現黃斑趨勢一樣。涂抹葉片黃斑面積較大，但顏色深淺有差異，特別是處理真葉，葉尖、主葉脈部位黃斑重；浸潤法黃斑明顯。斑跡與脫脂球形狀相同，同樣濃度黃斑顏色深、明顯：噴霧法黃斑呈隨機點狀，表現不均勻、不明顯，增加了調查誤差。3種方法相比較，以涂抹法較好，操作簡單，處理結果清晰，易調查。

2.2Kan處理種子臨界濃度篩選

甜瓜種子在不同濃度Kan溶液中均能萌發，但下胚軸、胚根發育差異明顯。超過一定濃度時，處理種子的下胚軸粗短，主根無任何側根、根毛，隨濃度加大差異更明顯，且根尖變褐、腐爛。播種到田間后，Kan處理過的種子出土晚。隨濃度增加出苗率、綠苗率降低，生長速度減慢，出土時間延長甚至不出土。由此可見。Kan不影響種子萌發，但卻明顯抑制芽、根系生長，這可作為一項易于鑒定轉化后代的指示性狀。表1表明，本試驗選用的3個甜瓜自交系Kan壓力有差異，Kan濃度為1100、800、600mg/L時，烏克蘭、雪里華、魯薄1號的綠苗率為0，Kan已將普通種子殺死，可確定為種子有效臨界致死濃度。

2.3Kan處理幼苗臨界濃度篩選

Kan對葉片傷害依次表現為黃化、白化、干枯、破損。1、2級反應可能是植株自身對Kan存在一定抗性，進行轉化植株檢測會增加假陽性，影響選擇效果；6級反應篩選壓力過強，造成轉化植株呈Kan陰性而逃逸。3～5級反應基本消除了植株本身對Kan處理的負面效應，可作為臨界篩選的標準。5級黃化指數為83.3％，因此以指數接近80％的Kan濃度作為臨界。表2結果表明，烏克蘭宜選用4000mg/L、雪里華選用5000mg/L、魯薄1號選用2500mg/L作為子葉臨界選擇壓；真葉對Kan反應比子葉敏感，3個試材的真葉臨界濃度分別為3500、5000～5500、2000mg/L。

另外，Kan處理甜瓜后的調查數據表明，3個材料的種子、幼苗對Kan反應呈一定正相關性，即種子接受Kan壓力高。幼苗臨界選擇壓相應較高，幼苗承受Kan壓力比種子高3～4倍。田間試驗發現，Kan處理過的甜瓜種子，雖然能較早篩選到綠苗。但后期部分植株無生長點，停留在1片或2片真葉甚至只有2片子葉狀態，無法進行后續研究。而處理真葉后Kan藥液易集留并沿葉柄流到生長點，也影響植株后期生長。因此。在實際應用研究中。處理子葉較為理想。

2.4花粉管轉化甜瓜種子的田間篩選與分子檢測

使用Kan臨界選擇壓處理3個甜瓜轉化種子、幼苗，結果見表3。烏克蘭、雪里華2個厚皮甜瓜真葉篩選后的綠苗率均高于種子、子葉處理，而魯薄1號篩選種子、子葉的綠苗率高于真葉。Kan⁺綠苗的PCR檢測結果表明，3個自交系的Kan檢測準確率以種子處理最高，子葉次之，真葉處理最低。因此，3個甜瓜真葉、子葉的Kan臨界質量濃度可適當提高。

Kan⁺綠苗的PCR及Southern雜交檢測結果見圖1、2。PCR陽性譜帶雜交信號有差異，1、3、4、5、7、12、13、14陽性譜帶無信號，與其對應的植株為假陽性，而其他較強的雜交信號說明外源基因已經整合到植株基因組DNA。

3、討論與結論

Kan對轉基因植物進行篩選實質上是通過Kan抗性基因NPT－II起作用的。Kan與植物細胞器中的核糖體30S亞基結合，阻止翻譯過程，干擾蛋白質合成。導致植物細胞死亡。NPT－II利用ATP的KP使Kan的某個特定羥基發生磷酸化，抑制Kan與核糖體相結合。植物葉片葉綠體等器官正常生長，無NPT-H基因的葉片失綠黃化。NPT-H作為標記基因一般與目的基因連鎖在一起。Kan處理植株后。若保持綠色，則認為目的基因已被轉入。本試驗根據此原理，利用適宜Kan臨界濃度篩選轉化攜帶NPT－II的Anti－MAI基因的甜瓜種子、幼苗?？梢灾庇^地在早期篩選出轉化株，大大減少后期工作量。

很多研究證實利用Kan對轉基因后代進行篩選是切實可行的，可應用于篩選轉化后代外源基因遺傳分離規律、轉基因種子純度、田間轉基因成株的篩選等。此方法簡單快速、經濟高效，檢測結果可靠，適用于生產試驗上的大面積應用。由于不同植物對Kan敏感性差異較大。使用時期、方法、濃度、環境條件等因素均影響轉化植株的篩選效率。因此，Kan臨界濃度的選擇是一個動態的過程，確定最佳選擇濃度是提高Kan篩選效率的關鍵問題。

本試驗結果表明，3個甜瓜自交系對Kan處理反應有差異，魯薄1號(薄皮)較烏克蘭、雪里華(厚皮)對Kan敏感性強。種子、幼苗對Kan抗性反應有一定相關性。即種子Kan選擇壓高，子葉相應表現出較高Kan抗性。甜瓜不同發育時期對Kan抗性水平不同，種子發芽期最敏感，較低濃度便產生致死，真葉次之，子葉Kan致死濃度最高。該結果與祝建波等人的研究結果一致。臨界濃度Kan篩選甜瓜轉化種子后，Kan⁺綠苗能夠得到PCR陽性譜帶及Southern雜交信號。因此，利用Kan對大量轉化甜瓜種子篩選能夠較快較早地篩選到轉化植株。