小麥胚芽鞘體細胞染色體制片技術初探

姚占軍　王嘉瑞　藺瑞明　馮　晶　徐世昌

摘要本試驗對小麥胚芽鞘體細胞染色體制片技術進行了初步探索。結果表明，利用小麥胚芽鞘細胞可以獲得理想的染色體制片，而且具有切取胚芽鞘對小麥個體植株傷害小，胚芽鞘體積大、分裂相多，易于制片，鏡下觀察染色體較大，雜質少，背景清晰等特點，可滿足染色體核型分析和染色體分帶的技術要求。初步建立起以小麥胚芽鞘為取樣對象的體細胞染色體制片方法。

關鍵詞小麥；胚芽鞘；染色體制片

中圖分類號Q 942

普通小麥通過遠緣雜交等手段獲得外源染色體(質)后，會導致個體的表型、染色體組成和結構特征等多方面的改變，表現(xiàn)為分離大、類型多、穩(wěn)定慢的特點。無論是轉移外源基因還是應用外源基因，都需要對外源染色質進行可靠、有效的檢測，因此對外源染色體(質)的檢測貫穿了小麥遠緣雜交的整個過程。外源染色體(質)檢測的基本手段是細胞學檢測。細胞學檢測基礎是染色體制片技術，而影響制片的因素很多，其中最基礎的環(huán)節(jié)就是取材。傳統(tǒng)的取材對象是小麥初生根的根尖(生長點)。由于小麥初生根數(shù)量有限，且對小麥個體損傷較大，因此謀求新的取材對象很有必要。

禾谷類作物種子萌發(fā)有3個階段，即種子吸脹、細胞分裂、芽鞘的伸長。以往研究認為成熟小麥種子中胚芽鞘已經(jīng)分化完畢，胚芽鞘伸長過程實質是后期的細胞擴大，而沒有細胞分裂參與。對此鄒琦等曾解釋，胚芽鞘細胞在胚中已分化完成，一旦開始生長便不再進行細胞分裂增殖，胚芽鞘的生長僅是細胞伸長，認為胚芽鞘伸長與膨壓有關，膨壓增加提供了胚芽鞘伸長延伸的動力。然而，陸長梅等在國內首次報道了在黃化小麥(Triticum aestivumL.)胚芽鞘中發(fā)現(xiàn)了正在分裂的細胞，這一發(fā)現(xiàn)為小麥胚芽鞘細胞學行為研究提供了新信息。迄今為止，國內尚未見到針對小麥胚芽鞘細胞染色體制片技術的相關報道。為此，本試驗以小麥胚芽鞘為取材對象，開展了體細胞染色體制片技術的探索，旨在為細胞學研究提供新技術。

1材料與方法

1.1小麥材料

小麥材料為中國春ph1b與中4雜交選育出的小麥抗條銹病品系P58-2，由中國農業(yè)科學院植物保護研究所條銹組提供。

1.2試劑

(1)卡諾固定液V(無水乙醇)：V(冰醋酸)=3：1；(2)0.1mol/LHC1；(3)45％冰醋酸；(4)染色液：改良苯酚品紅染液。

1.3小麥胚芽鞘細胞制片

染色體制片采用常規(guī)的壓片技術結合去壁低滲火焰干燥技術，并加以改進。

1.3.1小麥種子萌發(fā)

室溫或恒溫箱(25℃)浸泡若干P58—2種子至露白(胚根鞘突破種皮，圖1a)，置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內，于4℃下處理24～48h后，再移到室溫或恒溫箱(25℃)培養(yǎng)。

1.3.2預處理

待胚芽鞘長到種子長度一半至全長時進行離體預處理。取材時間在09:00～11:00，用刀片剝開胚芽鞘(刀片垂直于胚芽鞘)，用鑷子輕輕捏住胚芽鞘基部上提，取下胚芽鞘置于冰水混合物中，在4℃冰箱內進行預處理12～24h。

1.3.3固定和保存

將預處理后的胚芽鞘用卡諾氏固定液在4℃冰箱中固定12～24h，轉保存于70％乙醇中備用(-20℃冰箱長期存放)。

1.3.4解離和染色

將固定好的胚芽鞘用蒸餾水清洗20～30min，用濾紙吸干胚芽鞘上的浮水，浸于在60℃的水浴鍋中預熱的1mol/L HC1，解離3～5min(因材料、季節(jié)而異)去細胞壁，取出用蒸餾水清洗15～20min；取適量材料用45％冰醋酸直接壓片，火焰干燥后，相差顯微鏡下觀察；或用改良卡寶品紅染色15～20min，取適量材料用45％冰醋酸壓片，普通光學顯微鏡下觀察。

2結果與討論

通過與小麥傳統(tǒng)的根尖體細胞制片相比，觀察發(fā)現(xiàn)胚芽鞘體細胞制片也是行之有效的，而且具有如下特點：(1)切取胚芽鞘對小麥個體植株傷害小。傳統(tǒng)取材對象是小麥初生根根尖(生長點)，而種子萌發(fā)到離乳期之前，初生根在吸收水分和無機鹽等方面作用明顯，一旦截取將嚴重影響小麥幼苗生長；胚芽鞘是作物子葉應對生長初期逆境的保護組織，自然條件下胚芽鞘見光后即停止生長，由于胚芽鞘存在時間短，功能相對簡單，營養(yǎng)消耗小，因此胚芽鞘剝離后胚芽仍可生長，且對小麥個體植株生長傷害相對較小(圖1)。(2)胚芽鞘體積大、分裂相多，便于取材。在小麥種子發(fā)芽過程中，整個胚都要萌動即都有分裂相。雖然胚根生長先于胚芽包括胚芽鞘，但胚芽鞘生長速度會越來越快。傳統(tǒng)的根尖取材時問是當根尖長到0.5～1.5cm時取材，這時胚芽鞘也長到接近種子的長度或稍短，此時胚芽鞘的體積要遠遠大于小麥3條初生根根尖體積的總和，胚芽鞘內處于分裂狀態(tài)的細胞總數(shù)多于根尖，更利于小麥細胞學檢測。(3)胚芽鞘體細胞更易于制片。自然條件下，根需要不斷下扎，由于根尖細胞長期的進化，使其木質化程度提高。而胚芽鞘是一片不完全葉，胚芽鞘細胞木質化程度相對較低，故而HC1水解或混酶(果膠酶、纖維素酶和解離酶)解離細胞壁處理時間相應縮短，較根尖細胞解離時間縮短一半。因此，胚芽鞘細胞制片操作方便快捷，染色體易分散，更容易獲得良好制片。(4)與傳統(tǒng)的根尖體細胞染色體制片相比，胚芽鞘體細胞鏡下觀察染色體較大，雜質少，背景清晰，更適于染色體核型分析和染色體分帶(圖2)的技術要求。

控制預處理時間。預處理是染色體制片技術的關鍵環(huán)節(jié)。普通小麥通過遠緣或近緣雜交后代分離出的類型很多，種子發(fā)芽勢亦有不同。因此，預處理時間應根據(jù)材料的不同而異，一般預處理時間為24～72h。試驗中發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)傾向于普通小麥的程度越大，預處理時間應越短，但不能少于24h；反之，種子萌發(fā)傾向于遠緣或近緣物種的程度越大，預處理時間應越長，但不要超過72h。對于具體的某一小麥材料，若要確定其預處理時間，可設不同時間梯度確定。

控制HC1水解處理時間。HC1能解離細胞壁之間的果膠物質及部分細胞質。由于HC1直接作用于胚芽鞘細胞壁，解離充分與否直接關系到制片的好壞。解離不充分，制片時細胞不易分散，染色體集中成團；解離過于充分，制片時細胞易破碎，染色體易斷裂，得不到好的制片。本試驗將固定好的胚芽鞘用蒸餾水清洗20～30min，放入1mol/LHC1中在60℃水浴鍋中解離3～5min，獲得較為理想的解離效果。但因處理材料、季節(jié)以及水浴鍋精確度等因素而異，應設不同時間梯度來確定各自的解離時間。

小麥胚芽鞘取材過程中要盡量減少對萌發(fā)種子的損傷，應做到穩(wěn)、準、狠。(1)已萌發(fā)種子各器官都比較脆弱，特別是胚芽易折斷，取材時下手一定要穩(wěn)；(2)胚芽鞘緊貼子葉，取材時下手一定要準，以免傷到子葉；(3)胚芽鞘取材下手一定要狠，即取材要干脆利落，縮短操作時間；(4)取材時間在09:00～11:00，因為這段時間細胞分裂最旺盛。

3結論

研究表明利用小麥胚芽鞘細胞可以獲得理想的染色體制片，并初步建立起以小麥胚芽鞘為取樣對象的體細胞染色體制片方法。該方法具體操作步驟為：(1)在25℃恒溫箱內浸泡小麥種子至露白，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內于4℃下處理24～48h，再轉到24～25℃下發(fā)芽；(2)待胚芽鞘長到種子長度一半至全長時，于09:00～11:00取樣，置冰水混合物中預處理12～24h，再用卡諾固定液固定12～24h后，保存于70％乙醇中備用；(3)固定好的材料用蒸餾水清洗20～30 min，濾紙吸干覆水，放入1mol/L HC1中置于60℃水浴鍋解離3～5min，自來水清洗15～20min；(4)取適量材料用45％冰醋酸直接壓片，火焰干燥后，相差顯微鏡下觀察；或用改良卡寶品紅染色15～20min，取適量材料用45％冰醋酸壓片，普通光學顯微鏡下觀察。