經ＲＮＡｉ誘導的前脂肪細胞構建組織工程化脂肪組織

[摘要]目的：應用基因工程和組織工程的原理和方法，通過改造人前體脂肪細胞，提高其活性后，于裸鼠背部皮下構建組織工程化脂肪組織。方法：采用原代消化細胞培養法培養出前脂肪細胞，利用RNAi技術，誘導前脂肪細胞內的一個重要凋亡調控基因Bax基因表達沉默，然后接種到聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架上，種植在20只雌性裸鼠皮下，對獲得的脂肪組織進行組織學評價。結果：經過改造后的前脂肪細胞活性良好，術后裸鼠全部成活，前脂肪細胞能夠在支架上良好的存活，生長和增殖。結論：經過改造后的前脂肪細胞具有良好的活性，并且PLGA- 前脂肪細胞復合體在裸鼠體內可形成脂肪細胞，值得進一步研究， 以探索治療軟組織缺損的新途徑。

[關鍵詞]RNAi；Bax基因；組織工程；脂肪組織

[中圖分類號]Q813[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）10-1479-04

RNAi induced preadipocytes to build tissue engineering adipose tissue

ZHUANG Jian-hua1，ZHUO Yang2，ZENG Xing-ye2

(1.Department of Surgery， Lucheng People's Hospital， Wenzhou 325000，Zhejiang，China;

2.Department of Surgery， the 118th Hospital of PLA)

ObjectiveUsing genetic engineering and tissue engineering principles and methods， through the transformation of preadipocytes， enhancing its activity，and to construct tissue engineering adipose tissue in the back skin of nude mice.Methods Using primary-digest method to culture preadipocytes， using RNAi technology to induct an important apoptosis gene Bax gene expression silence in preadipocytes，and then inoculated into polylactic acid - glycolic acid copolymer (PLGA) scaffold ， planted in 20 female nude mice， the adipose tissue was carried out histological evaluation. Results After ransformation， the activity of preadipocytes is good， after all the mice survived. preadipocytes can survive well in the scaffold， growing and proliferation.ConclusionsAfter ransformation， preadipocytes has good activity， and PLGA- preadipocytes can be formed fat cells in nude mice， it is worth further study to explore the treatment of soft tissue defects in new ways.

Key words：RNAi；Bax gene；tissue engineering；adipose tissue

自體脂肪組織是修復各類組織缺損的最佳填充物，但體內脂肪組織一旦離開活體常易出現變性、壞死，如何獲取活性脂肪細胞，是脂肪組織移植成功的關鍵。前脂肪細胞是一類能夠增殖并向脂肪細胞分化的特異性前體細胞，為構建組織工程化脂肪組織的理想種子細胞。本研究從人體脂肪組織中提取人前脂肪細胞作為種子細胞，經體外培養擴增后，利用RNAi技術，誘導前脂肪細胞內的一個重要的凋亡調控基因Bax基因表達沉默，以促進前脂肪細胞的增殖和分化，抑制其凋亡，經上述處理的前脂肪細胞進行相關檢測后，再和可降解人工細胞外基質（PLGA）混合培養，于裸鼠背部皮下體內構建組織工程化脂肪組織，以探索治療軟組織缺損的新的途徑。

1材料和方法

1.1可吸收性支架材料：研究采用的可吸收支架材料為PLGA材料，其主要技術參數為：PLA與PGA共聚物，兩者單體的摩爾比為50:50，完全降解時間6～12個月，泡沫孔隙率為85%以上，孔徑200～300μm。

1.2裸鼠及脂肪組織的來源

1.2.1動物實驗用 BALB/C純合雌性裸鼠20只，鼠齡 6～8周，由南方醫科大學實驗動物中心提供。動物存放在預先消毒的微隔離器里，再置于隔離室的層流通風窗內。裸鼠1鼠1籠放置 ，用消毒的專用飼料和水喂養。

1.2.2選取于本院行切疤植皮術的正常體重患者，年齡20～45歲，無其他急慢性疾病，切取腹部正常皮下脂肪組織。

1．3 方法

1.3.1 原代培養：術中切取皮下脂肪組織，PBS洗滌，去除脂肪組織中肉眼可見的纖維及血管成分，剪切約20min，使之成為約0.5～1mm3的小組織塊，以1000r/min離心10min，取上層純脂肪顆粒，加入1%膠原酶，置于37℃，體積分數5%CO2培養箱內消化15h，再以1 500r/min離心3～5min，棄去上層漂浮的脂肪細胞和培養液，沉積的細胞用基礎培養基制成細胞懸液，反復吹打使之混合均勻，150μm尼龍網過濾，PBS洗滌并離心，吹打均勻，接種于35mm培養皿內，接種密度為每平方厘米1×104～2×104個細胞。培養皿內加入適量含20%胎牛血清，青、鏈霉素濃度均為100U/ml的全培，混合均勻，置于37℃，5%CO2孵箱內孵育，每天觀察，2～3天換液。

1.3.2 細胞傳代：當細胞生長接近單層匯合1/2時即進行常規傳代培養。以0.25%胰蛋白酶＋0.03%EDTA進行消化，于室溫下消化約1min，在倒置顯微鏡下觀察見胞質回縮、細胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量培養基，用吸管將細胞吹打下來，按1傳2的比例進行傳代，當傳代細胞生長接近單層匯合70%時，可繼續傳代。

1.3.3引物、siRNA模板設計及siRNA合成

1.3.3.1在GenBank中查找到人Bax基因mRNA(gi:34335114)：用PrimerPremier5.0軟件設計引物，Bax-sense:5′-gcttcagggtttcatccagg-3′，Bax-antisense:5′-tgtc cacggcggcaatca-3′，擴增片斷176bp。同源性檢驗未發現在 GenBank中有其它同源序列。應用Ambion公司靶點搜尋工具并結合RNAstructure分析結果，Bax基因mRNA抑制靶點選在130、131aa二聯堿基開始的5′-gacaggggcccttttgctt-3′，在序列3'端加上T7啟動子互補序列-cctgtctc，得到轉錄模板。siRNA合成遵照SilencerTMsiRNAConstructionKit說明書進行。

1.3.3.2轉染混合物制備：用無血清無雙抗的DMEM稀釋siRNA和轉染試劑，并將后者緩慢滴加入前者，siRNA和轉染試劑質量比為1:15，混合物室溫孵育備用。

1.3.3.3實驗分組及細胞轉染：待前脂肪細胞生長至60%～70%時，換轉染混合物的培養液2ml，36h后測Bax基因表達水平。

1.4 經過轉染后的前脂肪細胞培養

將PLGA切成5mm×5mm×0.5mm正方形小塊放入培養皿中，分別75%酒精浸泡消毒2h， 雙抗浸泡過夜，無菌PBS浸洗3遍，然后置入90mm無菌培養皿中干燥，用時再紫外線照射30min。實驗分2組 ，每組20個標本，Ⅰ組(實驗組): 將20個標本置于24孔培養板中，滴加適量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培養箱內預濕過夜，以增加其親水性，取1ml經酶消化的2×105/ml單細胞懸液置于PLGA海綿支架上，再加入2ml10%FBS DMEM培養液使其均勻分布；Ⅱ組（對照組）:將未接種細胞的單純支架材料滴加適量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培養箱內預濕過夜， 再加入2ml 10%FBS DMEM培養液，兩組靜置培養72h。

1.5 動物實驗方法：20只裸鼠按實驗分組，在裸鼠背部左右兩側用75%酒精消毒，于兩肩胛骨處各作一0.5cm切口，潛行分離形成皮下腔隙，將體外培養的兩組支架材料共40個樣本，于每只鼠背部皮下植入2個復合體（左側為I組，右側為II組），切口用5-0絲線縫合，傷口涂酒精后裸露，術后不用任何抗生素。裸鼠轉入各自籠內飼養后，每天觀察，在預定時間內切開背部皮膚，切取植入物，迅速置于10%甲醛或2.5%戊二醛中固定，以待進一步處理后作光鏡或電鏡檢查。

2結果

2.1 原代培養前脂肪細胞的形態學觀察：接種后細胞在數小時后貼壁，初為類圓形，細胞大小不等，核/漿比例較大，細胞核幾乎充滿胞漿。2～4天即逐漸伸展開，大多數細胞為長梭形，兩端尖細，尖端可延伸很長，有的細胞為多角形，立體感較強，胞漿內可見數量不等的線粒體，核橢圓形，較大，核仁較清晰（圖1）。2～3周可形成內含大小不等脂滴的多脂滴脂肪細胞，脂滴更可匯合形成單脂滴脂肪細胞，含脂滴細胞逐漸增多，最終可達到80%以上（圖2）。

2.2 siRNA-Bax對前脂肪細胞Bax基因表達水平的影響（圖3）：從圖中可以看出，陽性對照組中Bax基因表達水平明顯比陰性對照組要弱，說明siRNA-Bax對前脂肪細胞Bax基因表達水平起到了明顯的抑制作用。

2.3 培養的前脂肪細胞生長特性觀察：掃描電鏡觀察：PLGA材料均為珊瑚狀多孔結構，氣孔多為連通氣孔，氣孔分布為大孔-微孔結構，其中大孔孔徑為200～300μm，相互連通，在大孔孔壁上分布著孔徑5μm以下的微孔（圖4）。與細胞共孵育1周后，可見細胞呈橢圓球形或不規則形，緊密粘附于PLGA支架表面，細胞與材料及細胞間有絲狀纖維形成。

2.4移植物的生長特性觀察 術后裸鼠全部成活，完成實驗觀察。

2.4.1大體觀察：種植后傷口及種植區未見感染和種植物排出。第2周時，裸鼠兩肩胛區可各觸及有一皮下結節，推動該處皮膚，結節可同時活動，植入物同表面皮膚結合緊密，與底部肌肉組織結合疏松。切開皮膚，見植入物形狀改變，左側由原來的正方塊變圓變光滑，呈“鵝卵石”樣，有包膜覆蓋，包膜上有豐富小血管網，主要來自裸鼠皮膚，移植物的大小同植入前無明顯差別。右側移植物同植入前無明顯差別，有包膜覆蓋，包膜上無小血管網。第4周時， 左側移植物體積較植入前大，右側移植物體積較植入前小，切開皮膚，左側繼續變扁變光滑，有包膜覆蓋，來自裸鼠皮膚的血管進入包膜 ，然后廣泛發出分枝，質地變軟。右側開始萎縮，表面有包膜覆蓋，包膜上無小血管網，質地變軟（圖5）。

2.4.2 電鏡觀察：I組第2周，掃描電鏡可見前脂肪細胞在PLGA纖維上貼附生長， 部分細胞為長梭形，伸展良好，另一部分細胞為球形，未伸展開，另外可見部分小的球形細胞，可能為裸鼠的淋巴細胞。I組第4周，掃描電鏡見細胞呈扁平多角形或圓形，細胞數量明顯增多，呈聚集性分布，細胞周圍有大量基質，表明前脂肪細胞在支架上粘附、伸展和生長良好（圖6）。II組第4周，透射電鏡下見材料孔洞變大，不光滑，連續性不明顯，有崩解現象。

3討論

因先天性畸形、外傷及頭、頸、四肢的腫瘤切除術等各種原因所引起的全身各部位的組織器官的缺損不僅造成了外形上的缺陷，而且會引起不同程度的功能障礙，給患者的心靈帶來了巨大的傷害。自體脂肪組織是修復各類組織缺損的最佳填充物， 但如何保持移植脂肪組織生物活性一直是整形外科學界及所有修復外科面臨的重要難題之一。體內脂肪組織一旦離開活體常易出現變性、壞死，如整形外科最常見的小顆粒脂肪移植術，常因脂肪組織耐受組織缺氧能力差而出現壞死，究其原因是常規的整形技術是將供區數以萬計或十萬計脂肪細胞團塊即時移植至受區，由于營養障礙，大量移植脂肪細胞壞死，即使部分細胞成活，該成活脂肪細胞仍無擴增現象，極易褪化，移植后數月逐漸喪失脂肪細胞特性，由成纖維細胞逐漸替代[1-2]。如何保持其旺盛擴增狀態，維持其脂肪細胞特性，是脂肪組織移植成功的關鍵[3]。

組織工程學(tissue engineering)是近10多年提出的新概念，它是應用細胞生物學和工程學的原理，研究開發修復、改善損失組織結構和功能的生物替代物的一門科學。其基本原理和方法是將體外培養和擴增的正常組織細胞吸附于一種生物相容性良好并可被機體降解吸收的生物材料上形成復合物，將細胞生物材料復合物植入機體組織、器官的病損部分，細胞在生物材料逐漸被機體降解吸收的過程中形成新的形態和功能方面與相應器官、組織相一致的組織，從而達到修復創傷和重建功能的目的。組織工程一經提出，就受到各國學者的重視，組織工程發展至今已取得了豐碩的成果，目前已在軟骨、骨、皮膚、肝臟等領域取得可喜的進展[4-5]，某些組織已進入臨床應用。生物可降解材料是組織工程研究中主要采用的材料 ，有聚乳酸 (polylatic acid，PLA)，聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)和它們的共聚物 (PLGA)，聚丁酸(polyhydroxybutyrate，PHB)等，這些可吸收的ECM（extral cell material）已獲得美國FDA的批準，可應用于人體內。組織工程化的脂肪組織構建為解決上述問題提出一條新的思路。

種子細胞為組織工程的主要基本要素，脂肪細胞系由起源于中胚層的多能干細胞逐步分化、發育而成，其過程大致為:多能干細胞→間充質前體細胞→前脂肪細胞→成熟的脂肪細胞。前脂肪細胞(preadipocyte)是一類能夠增殖并向脂肪細胞分化的特異化的前體細胞，由于前脂肪細胞不含脂滴 ，體積小，有促血管生成特性，在細胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細胞更能耐受缺血與創傷，尤其在脂肪移植后的缺血期，使單個細胞比塊狀脂肪更易通過細胞融合而成活，而且前脂肪細胞在常規培養條件下即可生長(目前已可以常規培養人、鼠及豬的前脂肪細胞 ) [6]，使其有可能成為構建組織工程脂肪組織的理想種子細胞。但由于前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的影響因素較多，且作為脂肪組織工程基本要素的種子細胞即前脂肪細胞在體外培養過程中，細胞極易老化，從而喪失增殖和分泌基質的能力，如何防止細胞老化和獲得足量的細胞來源，是首先要解決的關鍵問題，而要解決這些問題，將組織工程與基因工程有機地結合，無疑是最有效的途徑。

眾所周知，Bcl-2與Bax是 Bcl-2基因家族中功能相反的兩個重要成員，分別具有抑制和促進細胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax的比值被認為是決定細胞生死存亡的關鍵點之一。據報道，肥胖大鼠棕色脂肪細胞處于產能靜止狀態，Bcl-2與Bax比值下降，細胞凋亡多，冷刺激或用腎上腺素處理后，該比值升高，細胞凋亡減少[7]。

RNAi是最近幾年發現和發展起來的新興的基因阻斷技術.近年來的研究表明，一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內某些基因致使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾(RNA interfenence，RNAi)。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，它可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具，將功能未知的基因的編碼區(外顯子)或啟動子區以反向重復的方式由同一啟動子控制表達，這樣在轉基因個體內轉錄出的RNA可形成dsRNA，產生RNA干涉 ，使目的基因沉默。Lassus P等人[8]研究證明RNAi技術作為一種實用工具，誘導哺乳動物細胞內的基因表達沉默，使得許多以前我們無法運用傳統的功能基因組學的技術方法研究的機制和模型成為可能，開創了研究基因和蛋白質功能的新天地。

本研究從人體脂肪組織中提取人前脂肪細胞作為種子細胞，經體外培養擴增后，利用RNAi技術，誘導前脂肪細胞內的一個重要的凋亡調控基因Bax基因表達沉默，以促進前脂肪細胞的增殖和分化，抑制其凋亡。經上述處理的前脂肪細胞進再和可降解人工細胞外基質（PLGA）混合培養，于裸鼠背部皮下體內構建組織工程化脂肪組織獲得初步成功，為以后探索治療軟組織缺損的新的途徑打下堅實的基礎。

[參考文獻]

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[8]Lassus P， Rodriguez J， Lazebnik Y.Confirming specificity of RNAi in mammalian cells[J].Sci STKE，2002(147):PL13.

[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-09-27

編輯/張惠娟