魚膠原肽抑制酪氨酸酶活性能力的比較研究

[摘要]目的：比較研究魚膠原肽與市場(chǎng)上同類產(chǎn)品抑制酪氨酸酶活性的能力。方法：利用受試物抑制酪氨酸酶催化底物（L－多巴）發(fā)生反應(yīng)從而減少黑色素生成的原理，以曲酸作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液在475nm的吸光值，通過(guò)吸光值比較各受試物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力。結(jié)果：與曲酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相比，20g/L質(zhì)量濃度的魚膠原肽溶液的酪氨酸酶抑制率可以達(dá)到30%以上，遠(yuǎn)強(qiáng)于市場(chǎng)上的同類產(chǎn)品，其抑制率隨濃度上升非線性增強(qiáng)。結(jié)論：魚膠原肽作為無(wú)毒副作用的純天然美白化妝品原料，擁有廣闊的發(fā)展前景。

[關(guān)鍵詞]酪氨酸酶；膠原肽；曲酸

[中途分類號(hào)]751，R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼][文章編號(hào)]1008-6455(2008)10-1512-03

Contrastive study on activity of tyrosinase inhibition of fish collagen peptide

CHEN Long，CHEN Dong-liang，YANG Guo-yan，WANG A-jing，TANG Liang-yan

（Wuhan Application Research Center for Peptide Substance of China Polypeptide Group，Wuhan430023，Hubei，China）

Abstract： ObjectiveCompare with and study on tyrosinase inhibition activity of fish collagen peptide and other similar products from market.MethodsBased on the tester's inhibition to catalyzing reaction of tyrosinase to its substrate（L-dopa）in order to reduce melanoma， and use kojic acid as standard control， compare tyrosinase inhibition activity of testers with absorbency of 475nm.ResultsCompare with standard control，the inhibition Rate of fish collagen peptide (20g/L) can beyond 30%，much more higher than any other products from market. And it's inhibition rate rises with it's concentration non-linearly.Conclusion As an innocuity，non side-effect and pure natural material of whitening cosmetic products，fish collagen peptide has broad prospects for development.

Key words：tyrosinase；collagen peptide；kojic acid

人類皮膚的顏色與皮膚中存在的色素的種類和數(shù)量有關(guān)，黑色素對(duì)皮膚顏色影響最大。黑色素在表皮基底部的黑色素細(xì)胞中形成。其過(guò)程為黑色素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌，最終形成黑色素。酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶[1]。

目前的皮膚美白劑就是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性或者阻斷酪氨酸生成黑色素的氧化途徑來(lái)減少黑色素的生成，從而達(dá)到美白皮膚的效果[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，存在于蜂蜜中的一種分子質(zhì)量約為600Da的多肽具有抑制酪氨酸酶活性的作用；從文蛤中分離到分子質(zhì)量為3 147Da的多肽對(duì)酪氨酸酶也有很強(qiáng)的抑制作用；Goetghebeur Kermasha[5]從A．niger中提取到一種金屬硫蛋白，也可抑制酪氨酸酶的活性，該蛋白選擇性地與重金屬如Zn2+，Cu2+，Cd2+或Hg2+等結(jié)合。以上3種物質(zhì)主要是通過(guò)與酪氨酸酶結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物來(lái)抑制酪氨酸酶的催化活性。

膠原的最小單元是膠原三肽（Collagen tripeptide）簡(jiǎn)稱CTP。其結(jié)構(gòu)可以表示為（Gly-X-Y），是一種在N端帶有甘氨酸的高純度的膠原三肽。在應(yīng)用于皮膚表面時(shí)，呈現(xiàn)出優(yōu)異的保濕效果[6]。微量射線自動(dòng)照相法研究表明，CTP的平均分子質(zhì)量約為280Da。

長(zhǎng)期以來(lái)膠原主要是從牛和豬等動(dòng)物組織中提取的。可近年來(lái)瘋牛病和口蹄疫的發(fā)生使人們開始考慮使用牛、豬膠原的替代品[7]。研究表明[8]，魚膠原肽具有安全性高、細(xì)胞粘結(jié)性好、透明、無(wú)臭和無(wú)刺激等特點(diǎn)，可作為化妝品的新原料。

用于實(shí)驗(yàn)的魚膠原肽，通過(guò)高壓液相色譜（HPLC）分析，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上為分子質(zhì)量小于1 000Da的小分子多肽，其中類似膠原三肽（Gly-X-Y）的小分子肽（分子質(zhì)量280Da左右）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%左右，而市場(chǎng)上同類產(chǎn)品的分子質(zhì)量多在2 000～3 000Da。由于魚膠原肽分子量很小，因而能更有效地滲入角質(zhì)層、真皮層，抑制酪氨酸酶活性?，F(xiàn)通過(guò)建立在體外的酪氨酸酶活性抑制強(qiáng)度的檢測(cè)方法來(lái)評(píng)價(jià)魚膠原肽和市場(chǎng)上同類產(chǎn)品對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1受試物

1.1.1魚膠原肽：采用魚類產(chǎn)品加工后的下角料（如魚鱗、魚皮）經(jīng)煮沸變性后，加入相應(yīng)蛋白酶恒溫水解，再經(jīng)一系列后處理制備而成，其蛋白質(zhì)含量≥90%，水分≤5.0%，灰分≤2.0%，其分子質(zhì)量在1 000Da以下的組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92%，其中類似膠原三肽（Gly-X-Y）的小分子肽（分子質(zhì)量280Da左右）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.9%，其分子質(zhì)量明顯小于現(xiàn)在市場(chǎng)上大多數(shù)膠原肽產(chǎn)品所宣傳的3 000Da[6]，且各項(xiàng)指標(biāo)均符合水解膠原蛋白國(guó)標(biāo)QB 2732-2005的要求。

1.1.2其他樣品：市場(chǎng)上的同類型膠原產(chǎn)品，共計(jì)7種，計(jì)為樣品1～7。

1.2 試劑與儀器：酪氨酸酶(25 000IU)，Sigma公司生產(chǎn)：L-多巴溶液，5g/L[1]（上海瀚鴻化工科技有限公司）；曲酸，20g/L[1]，（北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司）；磷酸二氫鉀（AR，河南焦作市化工三廠）；氫氧化鈉（AR，汕頭市西隴化工廠）。HH·W21·600型恒溫水浴鍋，武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠；722型紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Molelement摩爾元素型超純水機(jī)（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理：用超純水將受試物配成20g/L的溶液(酪氨酸酶是銅蛋白，溶液中不應(yīng)含有銅離子)作為樣品液備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)操作：在玻璃試管中進(jìn)行生化反應(yīng)，各管加入所需pH6.8磷酸緩沖液(磷酸二氫鉀6.8g和氫氧化鈉0.944g定容至1000ml)、樣品液、曲酸溶液（20g/L）和酶溶液（約7mg酪氨酸酶定容至100ml[9]）于37℃水浴中反應(yīng)10min，再依次加入L-多巴溶液(5g/L)，于37℃水浴中反應(yīng)10min，測(cè)475nm波長(zhǎng)的吸光值(optical density簡(jiǎn)稱OD值)。實(shí)驗(yàn)體系設(shè)計(jì)見表1。

2.3功效評(píng)價(jià)表示方法

2.3.1抑制率計(jì)算方法：樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制強(qiáng)度以抑制率表示。參照李莉[10]介紹的較簡(jiǎn)便方法，以陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為對(duì)照，按以下公式算出抑制率：樣品抑制率＝[陽(yáng)性對(duì)照吸光值－（樣品管吸光值－陰性對(duì)照吸光值）]/陽(yáng)性對(duì)照吸光值×100%，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照抑制率＝(陽(yáng)性對(duì)照吸光值－標(biāo)準(zhǔn)管吸光值)/陽(yáng)性對(duì)照吸光值×100%，抑制率高表明其對(duì)酶活性抑制強(qiáng)度高。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品參比：為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)室做檢測(cè)時(shí)都應(yīng)設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。我們選用曲酸作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，不同批次實(shí)驗(yàn)時(shí)，曲酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的抑制率會(huì)有所不同，可以將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的抑制率折算成100%，受試物的抑制率等比例變化后再作比較。如按照2.3.1的公式計(jì)算出受試物的抑制率為18%，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的抑制率為90%，折算后的受試物抑制率為18%/90%=20%。

3結(jié)果和分析

3.1受試物酪氨酸酶抑制率的檢測(cè)與比較：各受試物樣品液按照2.2中表1的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（吸光值）按照2.3.1的方法計(jì)算酪氨酸酶抑制率，按照2.3.2的方法加以折算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具體數(shù)據(jù)見表2。

由表2可以看出，魚膠原肽抑制酪氨酸酶活性的能力強(qiáng)于市場(chǎng)上的同類產(chǎn)品，就精密度而言各受試物的變異系數(shù)（CV）為：3.85～12.59%，均符合常規(guī)條件變異（RCV）小于15%的要求，大部分符合最佳條件變異（OCV）小于7%的要求。

3.2 魚膠原肽抑制酪氨酸酶活性的量效比研究：在驗(yàn)證魚膠原肽相對(duì)于市場(chǎng)上同類產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)以后，進(jìn)一步對(duì)魚膠原肽的量效比展開研究，即研究魚膠原肽溶液的濃度與其酪氨酸酶抑制率的變化關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)采用160g/L、80g/L、40g/L、20g/L 4種質(zhì)量濃度比較魚膠原肽的酪氨酸酶抑制力，操作步驟同2.2，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（吸光值）按照2.3.1的方法計(jì)算酪氨酸酶抑制率，按照2.3.2的方法加以折算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體數(shù)據(jù)見表3：

由表3可以得出，隨著魚膠原肽溶液濃度的增加，抑制率也相應(yīng)增加。就精密度而言，各濃度溶液酪氨酸酶抑制率變異系數(shù)（CV）為：1.16%～5.96%，均符合最佳條件變異（OCV）小于7%的要求，且T驗(yàn)證表明，不同濃度時(shí)魚膠原肽的酪氨酸酶抑制率存在極顯著差異（P＜0.01）。

4討論

通過(guò)體外試驗(yàn)，證實(shí)自制的魚膠原肽在同類產(chǎn)品中具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制能力。據(jù)人民網(wǎng)報(bào)道，日本政府已宣布禁止進(jìn)口和生產(chǎn)含有曲酸的化妝品，其理由為近來(lái)科學(xué)研究證明長(zhǎng)期接觸曲酸易使人患癌。為此，國(guó)家質(zhì)檢總局專門下文要求各地檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)對(duì)日出口的食品和化妝品中的曲酸加強(qiáng)監(jiān)控。魚膠原肽作為無(wú)毒副作用、純天然的美白化妝品原料，有望取代曲酸等毒副作用較強(qiáng)的化學(xué)合成化妝品添加劑，并可作為保健食品添加劑起到補(bǔ)充皮膚膠原的作用。

魚膠原肽的具體的作用機(jī)理可以分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即通過(guò)自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)多巴的結(jié)合位點(diǎn)，加速黑色素的分解與排泄，從而減少黑色素的沉積，或者是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即通過(guò)螯合銅離子，從而使酪氨酸酶失活，同時(shí)也可以抑制從多巴色素到5，6-二羥基吲哚-2-羧酸的互變反應(yīng)，減少黑色素的形成。魚膠原肽的作用機(jī)理是競(jìng)爭(zhēng)性抑制，或是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑或兩者都有，需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

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[收稿日期]2008-04-16[修回日期]2008-09-10

編輯/何志斌