基于Ｔａｑ Ｍａｎ ＭＧＢ探針的李痘病毒分子檢測(cè)

摘要：李痘病毒(Plum pox virus，PPV)是我圍對(duì)外檢疫性有害生物。研究根據(jù)該病毒不同分離株外殼蛋白(coatprotein，CP)基因的保守序列，設(shè)計(jì)了特異性引物與熒光探針，建立了基于Taq Man MGB分子探針的PPV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。方法特異性研究表明，針對(duì)PPV的2個(gè)主要流行株系M株系與D株系，均能夠得到典型擴(kuò)增曲線，ct值分別為14.96和18.22；而對(duì)于馬鈴薯Y病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒以及桃叢簇花葉病毒等其他毒株則沒(méi)有典型擴(kuò)增曲線，也無(wú)Ct值。靈敏度比較發(fā)現(xiàn)，該方法比雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的靈敏度提高1 000倍，具有快速、靈敏和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)PPV的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：李痘病毒：TaqMan MGB探針；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2009)04-581-04

李痘病毒(Plum pox virus，PPV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，主要侵染李屬木本植物，能夠引起葉片扭曲、褪綠，葉脈黃化，降低果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)。PPV在歐洲曾使感病品種的產(chǎn)量損失80％～100％。在自然條件下，PPV的傳播主要依賴蚜蟲(chóng)以非持久方式傳播，遠(yuǎn)距離擴(kuò)散途徑則主要通過(guò)感病植物繁殖材料的調(diào)運(yùn)。目前，PPV在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有分布的報(bào)道，是我國(guó)新頒布的進(jìn)境植物檢疫性有害生物。

針對(duì)李痘病毒的檢測(cè)已有生物學(xué)、血清學(xué)與RT-PCR方法。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(Real-time nuorescent RT-PCR)以其具有的高特異性、高靈敏度以及快速的優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多的應(yīng)用于疫病的檢測(cè)。它的原理是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入一條特異性的熒光探針，隨著探針的水解與信號(hào)的積累，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性產(chǎn)物的定性與定量分析。

普通TaqMan熒光探針的Tm值為65～72℃，片段長(zhǎng)度為25～40 nt，由于其高特異性的特點(diǎn)，如果探針與目標(biāo)基因序列沒(méi)有完全匹配，則會(huì)發(fā)生檢測(cè)效率低甚至沒(méi)有熒光信號(hào)的產(chǎn)生等問(wèn)題。因此，對(duì)于不同株系或分離物變異較大的病毒而言，由于難以設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段的完全匹配合適的熒光探針，就必須采用-TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探針技術(shù)。Taq—Man MCB探針由于3′端具有MGB分子，提高了探針的Tm值，從而使探針長(zhǎng)度縮短，以滿足整個(gè)熒光RT—PCR的檢測(cè)條件。

根據(jù)GenBank(http：／／WWW.ncbi.nlm.nih.gov)中的序列比對(duì)結(jié)果，李痘病毒各分離物外殼蛋白基因的同源性為87％～99％，序列中堿基變異比較多且分散，無(wú)法設(shè)計(jì)得到完全匹配的長(zhǎng)片段TaqMan探針。因此，建立基于TaqMan MGB探針的李痘病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，以期為出入境檢疫部門(mén)與相關(guān)研究機(jī)構(gòu)提供一項(xiàng)靈敏、穩(wěn)定的病毒快速檢測(cè)技術(shù)，防止國(guó)外危險(xiǎn)性有害生物傳入我國(guó)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

李痘病毒的陽(yáng)性物質(zhì)M株系(PPV-Marcus)和D株系(PPV-Dideron)均購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。樣品狀態(tài)為新鮮葉片經(jīng)液氮處理，磨成粉末狀，冷藏于4 ℃冰箱保存。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y.PVY)、香蕉苞片花葉病毒(Banana bract mosaicvirus，BBrMV)、小麥線條花葉病毒(Wheat streakmosaic virus，WSMV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecrottc ringspot virus，PNRSV)以及桃叢簇花葉病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)等陽(yáng)性物質(zhì)也都購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

PPV的雙抗體夾心酶聯(lián)(DAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

熒光探針與引物由上海基康生物公司合成，One Step RT-PCR Kit(Peffect Real Time)與DL-2000Marker購(gòu)自TaKaRa公司。實(shí)時(shí)熒光PCR儀為ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀。

1.2 樣品制備

PPV陽(yáng)性物質(zhì)按照說(shuō)明書(shū)要求加入樣品提取液，充分混勻后，2 000 r·min^-1離心lO min，上清為病毒原液。

取50 txL病毒原液加入到450 μL健康桃葉提取液中，混勻后，得到10^-1倍稀釋的含病毒樣品。再?gòu)闹腥?0μL加入到450μL健康桃葉提取液中，得到10^-2稀釋度的含病毒樣品，以此方法，分別得到10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀釋度的含病毒樣品。健康桃葉提取液為不含病毒的陰性樣品。

取不同稀釋度的含病毒樣品分成2份，每份體積100μL，一份樣品經(jīng)RNA提取后用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)靈敏度研究，另一份樣品直接用于DAS-ELISA靈敏度檢測(cè)，測(cè)試方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，當(dāng)樣品D_405nm≥2×陰性DD_405nm時(shí)，樣品被判定為陽(yáng)性，即攜帶有病毒。

1.3 病毒RNA提取

采用Trizol試劑方法提取

1.4 引物與探針設(shè)計(jì)

引物與探針的序列見(jiàn)表1。引物擴(kuò)增片段預(yù)期為64bp；探針5′端含有FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增體系參照One StepPrimeScrip^TMRT-PCR Kit(Peffect Real Time)說(shuō)明，反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR BufferlII 10 μL；RNase free dH₂O 6 μL；上下游引物(20 p，mol·L^-1)各0.6μL；熒光MGB探針(20 μmdl·L^-1)0.6μL；ROXreference dye(50×)0.4μL；TaKaRa EX Taq^TMHS(5U·μL^-10.4 μL；PrimeSeript^TM RT Enzyme Mixll 0.4μL；最后加入1μL的RNA模板，總體積20μL。每個(gè)樣品設(shè)一個(gè)平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照。

反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃5min，95℃lO s：然后95℃5 s，60℃31 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 結(jié)果分析

酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)果在BIO-RAD 680型酶標(biāo)儀上直接讀取D_405nm值。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR利用ABI 7000型熒光定量PCR儀自帶軟件SDS進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對(duì)照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴(kuò)增曲線及樣品Ct值由軟件自動(dòng)生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針的設(shè)計(jì)

為了獲得能夠檢測(cè)大多數(shù)或全部PPV分離株的引物與熒光探針，根據(jù)GenBank(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov)中已登錄的李痘病毒(D13751)的外殼蛋白基因序列，采用Blast程序進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示堿基變異多而分散。在部分序列的保守區(qū)，使用Primer Express 3.0軟件，設(shè)計(jì)得到既與目標(biāo)序列完全匹配又能夠與引物配合完成整個(gè)熒光反應(yīng)的TaqMan MGB探針(表1)。

2.2 PPV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

PPV檢測(cè)引物與熒光探針特異性研究顯示(圖1-A)，能夠以PPV的2個(gè)主要流行株系M株系和D株系RNA為模板，擴(kuò)增得到典型曲線，其Ct值分別為14.96和18.22，而未能從PVY、BBrMV、WS—MV、PNRSV、PRMV以及健康桃葉提取液等樣本中得到典型擴(kuò)增曲線，也無(wú)ct值。PPV與PVY、BBrMV以及WSMV同屬于馬鈴薯Y病毒屬，結(jié)合在NCBI中的同源性與特異性比較結(jié)果，表明這一對(duì)引物與熒光探針檢測(cè)PPV具有良好的特異性。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果也顯示本研究設(shè)計(jì)的引物與熒光探針對(duì)PPV具有非常好的特異性(圖1-B)。

2.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)PPV的靈敏度研究

PPV的不同濃度梯度樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)(圖2-A)，病毒原液以及10^-1～10^-4病毒稀釋液樣本均能夠得到典型擴(kuò)增曲線，根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)置閾值線，得到其Ct值分別是15.10、20.70、26.76、31.12和35.59。其中，10^-4病毒稀釋液的Ct值為35～40，經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，它們的Ct值仍然為35～40.根據(jù)判定原則鑒定為陽(yáng)性。10^-5與10^-6病毒稀釋液樣本未得到Ct值，被判定為陰性。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖2-B)，10^-1-10^-4病毒稀釋液樣本均能夠得到1條分子量約64 bp大小的明亮擴(kuò)增條帶，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同。因此，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定的陽(yáng)性結(jié)果與根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值判定的陽(yáng)性結(jié)果完全一致。

2.4 DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果

不同稀釋度的PPV病毒樣品經(jīng)DAS-ELISA反應(yīng)后，其結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，判定陽(yáng)性結(jié)果的臨界D₄₀₅值為0.306，10^-1稀釋樣品液的D₄₀₅值為0.525，高于臨界D₄₀₅值，被判定為DAS-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性，而10^-2稀釋樣品液的D₄₀₅值為0.286，低于臨界D₄₀₅值，被判定為DAS-ELISA檢測(cè)陰性。因此，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)靈敏度要比DAS-ELISA方法靈敏度高出1 000倍。

3 討 論

通過(guò)PPV外殼蛋白基因的同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPV的株系較多，不同分離株的CP基因序列中堿基差異多且分散，采用Primer Express 3.0軟件未能設(shè)計(jì)得到合適的引物與TaqMan探針。因此，本研究采用了TaqMan MGB探針技術(shù)，解決了這一技術(shù)難題。

由于目前常用的PPV檢測(cè)方法是DAS-ELISA法，因此，本研究對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法與成熟的DAS-ELISA試劑盒方法靈敏度做了比較，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)靈敏度比成熟的DAS-ELISA方法靈敏度高1 000倍。這項(xiàng)研究結(jié)果有助于檢測(cè)人員對(duì)PPV檢測(cè)方法的選擇。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法是在普通RT-PCR基礎(chǔ)上的擴(kuò)增，該方法同樣會(huì)產(chǎn)生RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示，通過(guò)產(chǎn)物判斷陽(yáng)性的靈敏度與通過(guò)擴(kuò)增曲線判定陽(yáng)性的靈敏度結(jié)果一致。

植物病毒由于難于提純與體外培養(yǎng)，在實(shí)際樣品中的含量又普遍較低，尤其是本研究中的李痘病毒，其在木本植物不同部位的分布不均勻且含量低，因此，本研究建立基于TaqMan MGB分子探針技術(shù)的高靈敏度實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，對(duì)于提高PPV的檢出率，防止該危險(xiǎn)性病毒傳入我國(guó)具有很大的意義。