基于ＳＲＡＰ的三倍體無子西瓜品種指紋分析和雜種純度鑒定

摘要：為了解三倍體無子西瓜品種SRAP(Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism)擴(kuò)增特點(diǎn)及其在三倍體西瓜雜種純度鑒定中的適應(yīng)性，利用SRAP引物組合對當(dāng)前生產(chǎn)上推廣的9個(gè)三倍體無子西瓜品種進(jìn)行了指紋分析和雜種純度鑒定研究。結(jié)果表明，1)30對引物組合中篩選出多態(tài)性引物組合24對，共產(chǎn)生109條多態(tài)性帶，平均每對引物組合產(chǎn)生多態(tài)性帶4.5條，單個(gè)組合的多態(tài)性比率在12.5％～80％。2)結(jié)合多對SRAP引物組合，可以鑒別不同品種。3)在黑蜜5號及其父母本的指紋分析中，發(fā)現(xiàn)有1對引物組合(ME4／EM3)在黑蜜5號雜交種上擴(kuò)增出了特異的條帶，可以區(qū)分母本和雜交種，試驗(yàn)證明該引物組合能夠用于黑蜜5號的雜種純度鑒定。

關(guān)鍵詞：無子西瓜；三倍體；DNA指紋；多態(tài)性；SRAP

中圖分類號：S651

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009—9980(2009)05—687—05

我國無子西瓜的種植面積有20多萬hm²。并且呈逐年增加的趨勢，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著突出的作用。然而隨著市場的開放，大量假冒無子西瓜品種開始出現(xiàn)并迅速蔓延。嚴(yán)重?fù)p害了推廣單位和種植農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)利益。構(gòu)建品種的特異DNA指紋，為新品種保護(hù)提供技術(shù)支撐顯得尤為迫切。Li等于2001年開發(fā)出了一種新的PCR標(biāo)記SRAP，該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對0RF_s(openreadingframes，開放式閱讀框)進(jìn)行擴(kuò)增，即由5’端的11個(gè)無特異性的填充序列和緊接著的AATT組成的核心序列以及3’端的3個(gè)選擇性堿基對內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。SRAP標(biāo)記多態(tài)性豐富，信息量大，且操作簡單，成本適中，已廣泛用于品種指紋圖譜和分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究。李嚴(yán)等優(yōu)化了西瓜SRAP標(biāo)記，并對生產(chǎn)上推廣的20個(gè)二倍體西瓜雜交種進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果表明SRAP引物組合鑒別能力較高，非常適合二倍體西瓜雜交種的純度鑒定。李曉慧等利用SRAP標(biāo)記分析了西瓜二倍體及其同源多倍體的多態(tài)性差異。SRAP標(biāo)記對三倍體無子西瓜是否具有普遍適用性，以及能否用于三倍體無子西瓜的純度鑒定，至今尚無報(bào)道。此項(xiàng)試驗(yàn)擬采用SRAP標(biāo)記形式對我單位研制推廣的部分無籽西瓜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探討無籽西瓜品種SRAP多態(tài)性，依此構(gòu)建品種的指紋圖譜，并對三倍體無籽西瓜品種的純度鑒定展開研究。

1 材料和方法

1.1 材料

11個(gè)供試材料均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所所有，供試材料的商品名和編號見表1。每份材料取20粒種子，破殼催芽后置于裝有細(xì)沙的培養(yǎng)盒中，在25℃人工發(fā)芽箱中培養(yǎng)lOd。CTAB法提取新鮮嫩葉的基因組DNA。

1.2 PCR反應(yīng)

SRAP引物參考Ferriol等引論文中的引物，從中選出5條正向引物和6條反向引物，正向引物和反向引物兩兩搭配，形成30個(gè)引物組合，引物序列見表2。SRAP程序設(shè)計(jì)參考Li等的方法，稍作修改。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，前5個(gè)循環(huán)的溫度設(shè)定為94℃1min、35℃1min、72℃2min；再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94℃1min、50℃1min、72℃1min；最后72℃5min延伸擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積101.μL，包含0.25mmol·L^-1dNTP_-1，1.5mmol·L₁MgCl₂，1.0μmol·L_-1引物，1.0UTaq酶。

1.3 顯色

采用北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)的JY5000型電泳儀。電泳1h后銀染，參考張軍等的方法，略有改進(jìn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

銀染后的凝膠利用照相機(jī)拍攝保存，并記錄泳帶數(shù)據(jù)。有帶記為1，無帶記為0。每個(gè)引物組合的多態(tài)性比率(％)=引物組合擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)／總條帶數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性分析

30個(gè)引物組合用于9個(gè)三倍體無子西瓜DNA的SRAP擴(kuò)增。除了6對組合ME5／EM1、ME5／EM2、ME5／EM3、ME5／EM4、ME5／EM5、ME5／EM6不能擴(kuò)增出條帶外，其余24對引物組合均能擴(kuò)增出清晰的條帶，并且都能揭示出多態(tài)性(表3)。24個(gè)引物組合共產(chǎn)生有效片段312條，平均每對引物組合產(chǎn)生13條，312條擴(kuò)增帶中多態(tài)性條帶109條，平均每對組合產(chǎn)生多態(tài)性條帶4.5條，每對組合的多態(tài)性條帶1a～11條不等，單個(gè)組合的多態(tài)性比率在12.5％～80％。這表明SRAP多態(tài)性較高，適用于三倍體無子西瓜的遺傳差異及DNA指紋圖譜分析。

2.2 品種的特異DNA指紋圖譜與品種鑒別

沒有找到能區(qū)分全部9個(gè)品種的引物組合，引物組合ME1／EM6鑒別力最強(qiáng)，可以把T1、T2、T3、T4、T6和T8共6個(gè)品種一一區(qū)分開。如圖1-B箭頭所示，T1和T8都含有400bp的特征帶，但T8缺失了150bp的特征帶，T2具有150bp的特征帶，而T3缺失了130bp的特征帶。引物組合ME4／EM3的擴(kuò)增帶可以區(qū)分品種T3、T5和T6。ME4／EM3共擴(kuò)增出10條帶，其中多態(tài)性帶有8條，T5具有200bp的特征帶，可以與，17和T9區(qū)分開，T6具有150bp的特征帶，可以與T3區(qū)別。而T2、T7和T9指紋相同，T1、T4和T8指紋相同，彼此無法相互區(qū)分。其它引物組合與ME4／EM3相似，雖然具有較高的多態(tài)性，卻僅能區(qū)分少數(shù)幾個(gè)，甚至不能區(qū)分開任何一個(gè)品種。如ME1／EM2、ME1／MEl4、ME2／EM5和ME3／EM3能分別區(qū)分開2個(gè)品種，ME1／EM1、ME1／M3、ME2／EM1、ME2／EM3、ME2／EM6、ME3／EM5、ME4／EM1和ME4／EM4僅能分別區(qū)分開1個(gè)品種，其余組合不能區(qū)分開任何一個(gè)品種。雖然依靠單一的引物組合難以區(qū)分所有9個(gè)品種，如果把ME4／EM3，ME1／EM6和ME3／EM3引物組合搭配在一起，便可以把所有9個(gè)品種一一區(qū)別分開。

2.3 三倍體雜種與父母本的鑒定

為了研究SRAP標(biāo)記能否用于三倍體無子西瓜的純度鑒定，利用以上24對有效的引物組合對黑蜜5號及其父母本進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5對引物組合能在親本間產(chǎn)生多態(tài)性。分別為ME1／EM3、ME1／EM5、ME4／EM3、ME4／EM4和ME4／EM5，其中有2對引物組合ME4／EM3和ME4／EM5可區(qū)分母本和雜交種。圖2為引物組合ME4／EM3的擴(kuò)增結(jié)果，如箭頭表示，黑蜜5號的母本缺失了一條來自父本的特異帶，而該條帶能夠在黑蜜5號上穩(wěn)定遺傳，可以把雜種與母本區(qū)分開。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)認(rèn)為，該特異條帶信號強(qiáng)，重復(fù)性好，理論上能夠用于雜種的純度鑒定。

2.4 黑蜜5號雜種純度鑒定的驗(yàn)證

在黑蜜5號與父母本的鑒定研究中我們找到了一對引物組合ME4／EM3可以區(qū)分雜種與母本，為驗(yàn)證該引物組合純度鑒定的適用性和準(zhǔn)確性，把26粒黑蜜5號種子和1粒母本種子人為隨機(jī)混雜，人工發(fā)芽后分別提取DNA，并用ME4／EM3擴(kuò)增。結(jié)果在第7號樣品發(fā)現(xiàn)了父本和雜種特異帶的缺失(圖3箭頭所示)，而其他26個(gè)泳道條帶與黑蜜5號擴(kuò)增條帶完全相同，特異帶都能夠穩(wěn)定遺傳。可以推斷第7份樣品為黑蜜5號中混入的四倍體母本。該試驗(yàn)證明SRAP引物組合ME4／EM3可以用于三倍體無子西瓜品種黑蜜5號的純度鑒定實(shí)踐。

3 討論

DNA指紋技術(shù)已廣泛用于品種鑒定、種子純度檢測、新品種審定和植物遺傳資源多樣性分析等領(lǐng)域，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。目前用于西瓜品種鑒定和遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記主要是RAPD、SSR、SCAR、AFLP和SSR，這些標(biāo)記各有優(yōu)缺點(diǎn)。SRAP標(biāo)記可直接檢測基因的閱讀框(ORF)區(qū)域，上游引物和下游引物可以通用，兩兩搭配組合，提高了引物的利用效率。與SSR相比，省卻了引物開發(fā)的困難，同時(shí)它相對RAPD重復(fù)性較好，又克服了AFLP技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴的缺點(diǎn)。目前已在多種植物上得到成功應(yīng)用。李嚴(yán)等對生產(chǎn)上推廣的20個(gè)二倍體西瓜雜交種進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果表明SRAP引物組合鑒別能力較高。非常適合二倍體西瓜雜交種的純度鑒定。李小慧等用SRAP對12個(gè)二倍體西瓜品種的多態(tài)性進(jìn)行了分析，從25對引物組合中篩選到8對多態(tài)性較高的組合，每對引物組合能產(chǎn)生多態(tài)性帶3～7條，平均4.6條，研究認(rèn)為SRAP多態(tài)性較高，適用于西瓜等遺傳差異小的作物。本研究對9個(gè)三倍體無子西瓜品種指紋進(jìn)行了SRAP分析，發(fā)現(xiàn)30對引物組合中有24對能夠有效擴(kuò)增，并且全部都有多態(tài)性條帶產(chǎn)生。平均多態(tài)性條帶為4.5條。依據(jù)品種的特異指紋，組合數(shù)個(gè)多態(tài)性較高的引物對，便可以把9個(gè)參試品種一一區(qū)分開。本研究表明，SRAP標(biāo)記具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，條帶清晰，產(chǎn)率中等，可以在三倍體無子西瓜中產(chǎn)生較高的多態(tài)性，完全適用于三倍體西瓜的鑒定和遺傳分析。但與李嚴(yán)等倍體西瓜SRAP擴(kuò)增的結(jié)果相比，本試驗(yàn)中平均每對引物組合產(chǎn)生的有效擴(kuò)增帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)都相對較低，分析認(rèn)為主要是參試的材料、引物對的擴(kuò)增能力以及三倍體遺傳背景的差異造成的。

本試驗(yàn)在無子西瓜品種指紋分析的基礎(chǔ)上，又對SRAP標(biāo)記用于三倍體雜種純度鑒定實(shí)踐的可能性進(jìn)行了探討。試驗(yàn)利用24對引物組合對黑蜜5號及父母本進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)有5對引物組合能在親本間產(chǎn)生多態(tài)性，其中引物組合ME4／EM3在母本和雜交種間的差異非常明顯，且重復(fù)強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確鑒別出與三倍體雜種混雜的四倍體母本。西瓜雜種純度的分子標(biāo)記鑒定研究已多有報(bào)道。但前人的研究手段多以RAPD為主，或者是RAPD轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記。由于西瓜作物本身遺傳相對狹窄，RAPD標(biāo)記多態(tài)性檢測能力相對較低。要找到合適的標(biāo)記往往需要篩選大量的引物。如歐陽新星等從320個(gè)RAPD引物中僅篩選到3個(gè)引物能在無子京欣一號雙親間產(chǎn)生多態(tài)性。只有一對引物可以把雜交種和母本區(qū)分開。SRAP標(biāo)記與RAPD相比較多態(tài)性強(qiáng)，且重復(fù)性好。篩選少量的引物組合就有可能找到親本間的差異標(biāo)記，實(shí)用性較強(qiáng)。如王從彥等從64對SRAP引物組合中篩選到2對組合可用于5份二倍體西瓜雜交種的純度鑒定。研究表明SRAP標(biāo)記的檢測能力高于田間種植鑒定。本文的研究也表明SRAP標(biāo)記用于三倍體西瓜雜交種的純度鑒定是高效的、可靠的。

研究中發(fā)現(xiàn)SRAP擴(kuò)增能力較強(qiáng)。引物對產(chǎn)生的譜帶可以達(dá)到十幾條甚至幾十條，譜帶的強(qiáng)弱甚至有無受PCR反應(yīng)條件和顯帶技術(shù)的影響較大。因此SRAP譜帶的判別和取舍有一定的難度。王從彥等認(rèn)為重復(fù)性的好壞應(yīng)作為SRAP多態(tài)性標(biāo)記重要的取舍指標(biāo)，同時(shí)兼顧擴(kuò)增譜帶的強(qiáng)弱。為提高SRAP鑒定的穩(wěn)定性，鑒定時(shí)應(yīng)需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，然后選取穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性好的引物對用于試驗(yàn)分析，且在統(tǒng)計(jì)譜帶時(shí)選取穩(wěn)定性較高的譜帶進(jìn)行記錄。就SRAP標(biāo)記而言，筆者認(rèn)為針對不同的生物材料進(jìn)行PCR反應(yīng)和銀染技術(shù)優(yōu)化有一定的必要性。優(yōu)化能夠減少非特異擴(kuò)增帶的干擾，提高鑒定的準(zhǔn)確性與真實(shí)性。

4 結(jié)論

SRAP標(biāo)記在三倍體無子西瓜品種問能揭示出較高的多態(tài)性，平均每對組合產(chǎn)生多態(tài)性條帶4.5條，單個(gè)組合的多態(tài)性比率在12.5％～80％。引物組合的鑒別能力有一定的差異，結(jié)合多對引物組合，可以把參試品種一一區(qū)分開，表明SRAP標(biāo)記可以用于三倍體無子西瓜品種核酸指紋分析和品種鑒別。試驗(yàn)從24對引物組合中篩選到5對組合能在黑蜜5號雙親間產(chǎn)生多態(tài)性，其中引物組合ME4／EM3能準(zhǔn)確鑒別出混雜于三倍體雜種中的四倍體母本，能夠用于黑蜜5號雜交種的純度鑒定。