表皮干細胞用于瘢痕治療的研究進展

【文獻標識碼】B

【文章編號】1673－0364（2009）－06－0352－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.017

作者單位：200233上海市　上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院整形外科。

瘢痕組織是人體創傷修復過程中的自然產物。在正常的創傷愈合過程中，成纖維細胞合成和分泌以Ⅰ型膠原纖維為主的細胞外基質，膠原的合成代謝與降解代謝之間維持著平衡狀態,無論是膠原合成的增加或者降解的減少都會導致膠原的大量堆積，最終導致增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩的形成 [1，35]。主要合成和分泌膠原纖維的（肌）成纖維細胞 [2-3]，在細胞增殖和凋亡之間也維持著平衡狀態 [4-5]。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中這種平衡被破壞，（肌）成纖維細胞的增殖超過了凋亡，膠原的合成明顯超過降解，最終導致大量的膠原堆積。導致這種變化的確切病因尚不清楚，但是在燒傷患者中，增生性瘢痕往往發生于延遲愈合的患者身上。采取了網狀皮片移植的患者，常在沒有表皮覆蓋的肉芽組織間發生增生性瘢痕，在缺乏上皮覆蓋的傷口，真皮內的成纖維細胞會分泌更多的細胞外基質。臨床觀察的結果提示，正常的表皮結構對于瘢痕形成有抑制作用。在皮膚損傷的修復過程中，表皮干細胞對于上皮的修復起著重要的作用，意味著表皮干細胞對于瘢痕的預防和治療具有積極的意義。

表皮干細胞主要定位于毛囊外根鞘隆突部及皮膚基底細胞層 [10]，毛囊外根鞘隆突部是皮膚干細胞的主要棲存地。表皮干細胞不但對毛囊生長、修復和新陳代謝起關鍵作用，且對表皮損傷后的修復同樣具有重要意義。表皮干細胞具有多向分化潛能，可分化為毛干、內髓鞘、外髓鞘、和皮膚表皮角質細胞以及皮脂腺等 [1]，創傷修復后的表皮細胞也來自于基底層干細胞或者周圍附屬器內的表皮干細胞的激活和增殖。目前，表皮干細胞的表面特異性標記物尚無定論，但較多采用一些細胞表面糖蛋白，如整合素家族的Integrinβ1和Integ鄄rinα6、角蛋白K19、基因物質P63等作為主要鑒定手段 [10]。近來發現表皮干細胞不僅是形成正常表皮增殖單位必不可少的來源，而且相關實驗證實了表皮干細胞在創傷應激刺激后快速形成短暫增殖細胞，然后進一步形成角質細胞被快速募集至創面中心完成上皮化過程及創面修復。正常的上皮化過程對于傷口愈合十分重要，如果上皮化的持續時間超過3周，就會發生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36]。

本文對表皮干細胞如何通過各種信號通路的調節影響修復的進程和結果，以及表皮干細胞如何通過上皮化作用影響傷口愈合而形成瘢痕等問題進行綜述。

1　表皮干細胞參與創傷愈合的信號通路

1.1 Wnt信號通路

Wnt信號通路是動物的胚胎發育和組織器官形成時期的重要信號轉導途徑，主要通過細胞與細胞間的信號轉導調節細胞增值、分化、凋亡及抗凋亡過程。Wnt信號通路主要指經典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenine信號通路和10個非經典的Wnt信號通路：Wnt/PCP（Planar cell polarity）信號通路，Wnt-cGMP、Ca 2+信號通路，Wnt-RAP1信號通路，Wnt-ROR2信號通路，Wnt-PKA信號通路，Wnt-GSK3-MT（Microtubule)信號通路，Wnt-aPKC信號通路，Wnt-RYK信號通路，WntmTOR信號通路等 [46-47]。Wnt在細胞膜上有兩種受體：Frizzled受體和脂蛋白受體。細胞外的Wnt蛋白與細胞膜上的受體結合之后，受體在磷酸化后通過下調GSK3β將信號傳遞到細胞內，解除APC蛋白、糖原合成激酶（GSK-3β)、軸素(Axin)、蛋白酶復合體體對β-連環蛋白的抑制，活化之后的β-連環蛋白進入細胞核，與Lef/Tcf家族的轉錄因子結合，從而激活轉錄因子，進一步激活靶基因開始轉錄。通常情況下，成體哺乳動物的Wnt基因在機體中處于靜息狀態；皮膚損傷時，激活了深層皮膚，Wnt基因表達Wnt蛋白，Wnt蛋白激活隆突部的表皮干細胞使其增殖、分化以實現皮膚損傷的修復 [48]。

Fathke等 [49]在傷口局部使用氯化鋰抑制糖原合酶激酶3GSK-3β使β-catinen積聚，從而增強Wnt信號通路表達，發現毛囊間表皮細胞再生模式被改變，表皮創傷愈合面形成包含有毛囊結構和皮脂腺結構表皮囊腫。這說明表皮細胞在受到增強的Wnt信號誘導后可以轉化為類似毛囊的形態，是Wnt信號決定了皮膚細胞分化的方向。在細胞核內，Lef/Tcf家族不同的因子在通路中發揮不同作用，在正常毛囊干細胞中，Tcf3的表達被抑制而正常表達Lef1，Lef1與β-catinen協同作用促使短暫增殖細胞進一步分化形成內毛根鞘。當毛囊干細胞內β-catinen在胞質表達穩定時，Tcf3的抑制被解除，毛囊干細胞被激活，分化并參與毛囊和表皮的增殖再生 [50]。

1.2 FGF信號通路

FGF家族成員擁有由大約120個同源氨基酸殘基序列組成的核心區域，FGF受體為絡氨酸激酶受體，分為FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等亞型，各亞型都具有細胞外的免疫球蛋白樣結構域和細胞內的絡氨酸激酶結構域。FGF與硫酸乙酰肝素粘多糖緊密結合后，與細胞膜上的絡氨酸激酶受體結合，受體形成二聚體，細胞內的絡氨酸激酶活化，受體自身啟動磷酸化過程 [51]。活化的受體通過FRS2-GRB2-GAB1-PI3KAKT信號級聯放大通路，最終下調GSK3β的表達，解除βcatenin的抑制，活化后的β-連環蛋白進入細胞核，與Lef/Tcf家族的轉錄因子結合，從而激活轉錄因子，進一步激活靶基因轉錄。FGF信號通路通過該途徑與Wnt信號途徑相互作用，調節毛囊中表皮干細胞的分化方向，在創傷修復中起重要作用。

FGF最初是作為成纖維細胞或上皮細胞生成促進因子被發現的，現已明確它們在脊椎動物胚胎形成過程具有調節干細胞發育方向的功能。Stern等 [52]使用外源性方法阻斷小鼠胚胎發育中的外胚層對成纖維生長因子（FGFs）的反應，沒有FGFs表達的細胞中骨形成蛋白（MBPs）的表達增強，促使神經外胚層向神經分化受抑制，而分化成胚胎表皮。Kawano等 [53-54]對小鼠全層皮膚中的mRNA進行定量分析以了解FGF家族的22個成員及其受體的表達情況，發現FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF10、FGF13、FGF18、FGF22在皮膚中表達于毛囊增殖周期的不同階段，不同的FGF有著不同的表達高峰，其中FGF18能促進體外培養的人成纖維細胞、毛囊隆突細胞、表皮角質細胞和血管內皮細胞的DNA合成，對毛囊形成及毛囊干細胞參與創面修復過程有重要促進作用。應用RT-PCR和原位雜交檢測發現，FGF13 mRNA在毛囊再生和創傷修復中表達水平增高，免疫組化檢測提示FGF13蛋白僅在毛囊隆突區域表達。FGF13可能在調節毛囊bulge細胞以及表皮基底層細胞的功能上發揮作用

1.3 BMP/TGF-β信號通路

骨形態發生蛋白（BMPs）是TGF-β超家族成員中最大的一族，通過調節一群廣泛多樣的基因活性，控制著機體組織器官的基本發育過程。BMPs與BMPⅡ型受體結合，Ⅱ型受體其胞質段的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域活性升高，能持續作用使Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體，磷酸化后的Ⅰ型受體又能使轉錄因子Smad磷酸化，并與Smad結合構成復合物進入核內，啟動下游靶基因的表達 [55]。Smads蛋白是TGF-β1家族傳遞受體信號到細胞核內的細胞內信號轉導分子，是目前所知唯一的激酶受體激活后在細胞內的底物。受體激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，可被Ⅰ型受體特異的絲氨酸激酶磷酸化而活化，然后才能與Co-Smad（即Smad4）結合并形成復合物，轉移到核內調控轉錄。Smad6和Smad7屬于抑制性Smads，可與活化的Ⅰ型受體競爭性結合，阻止其他類型Smads的磷酸化，從而抑制信號轉導 [56]。

在毛囊增殖周期中，處于真皮中的BMP2、BMP4也隨之發生周期性改變，在毛囊的退行期BMP2、BMP4呈高表達，在毛囊周期的恒定增殖期卻處于低表達水平，這正好與Wnt/β-catinen在毛囊周期中相同時期的表達相反。BMP在毛囊干細胞周圍的穩定表達可維持毛囊干細胞的靜息狀態，阻止了毛囊干細胞的激活，卻可以促進毛囊角質細胞的進一步分化而促使毛囊分化成熟 [57]。Smad4主要通過激活細胞凋亡通路來維持TGF信號誘導毛囊進入退行期，BMP和Wnt/β-catinen兩條信號通路相互制衡以調節毛囊干細胞毛囊周期和表皮再生。

1.4 Notch信號通路

Notch基因編碼一種膜蛋白受體，它的兩種膜蛋白配體Delta和Serrate表達在相鄰細胞的細胞膜上。當配體和Notch的胞膜外區結合時，Notch的胞內區(Intracellular domain of Notch，ICN)被金屬蛋白酶（MMP）或γ分泌酶切割，脫離細胞膜成為具有活性的游離狀態。活化的ICN被轉運入細胞核并與Su（H）（Suppressor of Hairless）即RBP-Jκ結合，Su（H）單獨存在時是一種抑制性的轉錄因子，ICN的結合使Su（H）轉變為轉錄激活子，激活Notch誘導基因（Notch2 inducible genes）的轉錄。ICN-Su（H）復合物直接誘導轉錄的靶基因是E（spl）（Enhancer of Split），E（spl）是堿性螺旋-環-螺旋（basic helix2loop2helix，bHLH）類轉錄因子，它又調節其他與細胞分化直接相關的基因的轉錄 [64]。Notch信號通路通過參與Wnt信號的下游通路決定著表皮干細胞的分化方向。

其他調節表皮干細胞參與創傷修復的信號通路還有MAPK通路、鈣粘蛋白-NFATc1-CDK4通路等，它們之間具有復雜的交聯關系，在毛囊干細胞參與創傷修復的過程中相互聯系構成一個網絡系統。毛囊干細胞通過一系列復雜的調節最終完成傷口的上皮化。研究結果表明，阻斷通路的某些步驟或者改變某些關鍵信號分子的含量，可以實現對于表皮干細胞分化的調控，而有望實現創傷無瘢痕愈合。

2　上皮化過程對于成纖維細胞的影響

創傷的愈合過程分為3個階段：炎癥反應階段、增殖階段以及塑形階段 [6-7]。在傷口的上皮化過程中，根據傷口深度的不同，上皮化的方式有所不同。如果皮膚的基底層是完整的，缺損的表皮由皮膚基底細胞層內的表皮干細胞以自下向上分化增殖的方式進行修復。如果皮膚的基底層受到破壞，傷口則由傷口邊緣附屬器內的表皮干細胞向傷口方向分化、增殖、遷移而進行修復 [8-10]。

正常的上皮化過程對于傷口的正常愈合十分重要，如果上皮化的持續時間超過3周，就會發生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36]，表皮細胞在表皮化的過程中受到來自表皮細胞自身以及真皮層的多重調節。表皮細胞遷移、增值、分化的過程通過可溶性的細胞因子以旁分泌、自身分泌的形式相互作用 [14]。傷口形成之后，表皮細胞分泌儲存的IL-1α，IL-1α活化成纖維細胞和鄰近的表皮細胞，趨化內皮細胞和淋巴細胞到創傷區域 [15]。成纖維細胞依次分泌FGF7、GM-CSF，進一步活化基底層附近的表皮細胞，活化過程同時受到來自創面的巨細胞、表皮細胞、單核細胞、巨噬細胞所分泌的TNF-α EGF家族（TGF-a、EGF、HG-EGF）、CXCL8和IFN-g的調控 [15-16]。在傷口正常上皮化過程結束后活化停止，但是在增生性瘢痕中表皮細胞在上皮化結束后仍然處于活化狀態 [17-19]。受傷后24 h，表皮細胞在巨噬細胞、成纖維細胞、表皮細胞分泌的TGF-b1、HB-EGF、EGF、TGF-a、HGF、NGF、FGF7、VEGF、CXCL1、IL-6 和GM-CSF作用下開始增殖 [20-22]。沒有來自于成纖維細胞的信號，表皮細胞無法形成具有功能的上皮 [23]。增殖階段結束后，表皮細胞在FGF7和GM-CSF刺激下開始分化 [24]。與愈合早期不同，在愈合終末期，成纖維細胞分泌的TGF-β誘導表皮細胞由活化狀態轉化為失活狀態 [15]，失活的表皮細胞又誘導成纖維細胞減少膠原的生成 [25-26]。和正常瘢痕組織內的表皮細胞相比，增生性瘢痕內表皮細胞的增殖和分化能力都有不同程度的提高 [18，27]。活性增強的表皮細胞減少了IL-1的分泌并提高PDGF的表達，從而直接促進了成纖維細胞膠原的合成與分泌 [28]。在體外聯合細胞培養中，瘢痕疙瘩來源的活化的成纖維細胞可以誘導正常皮膚的成纖維細胞大量合成CTFG、TGF-β、VEGF [39-31]，并且促進膠原合成與分泌 [32-33]。

3　干細胞應用于瘢痕治療的研究進展

表皮干細胞的增殖分化行為，一方面被細胞本身所預先程序化，另一方面又受其所處的微環境（干細胞壁龕）的影響，即干細胞壁龕通過細胞與細胞、細胞與細胞外基質兩種方式調控干細胞的增殖分化，細胞因子在傳遞細胞與細胞外基質之間、細胞與細胞之間的信息中起重要作用，細胞外基質成分，如纖維結合蛋白、層黏連蛋白以及不同類型的膠原等均參與了表皮干細胞特征的維持及其增殖、分化等生物學行為的調控 [40]。

表皮干細胞在瘢痕治療方面的研究及應用進展主要集中在兩個方面。

①應用EGF促進傷口原位的表皮干細胞生長，加速上皮化的過程。

表皮干細胞在傷口上皮化過程中起著重要作用。許多調節因子，例如細胞因子、生長因子誘導并且調節傷口原位表皮干細胞的聚集、增殖和分化，以此促進傷口上皮化和傷口愈合。Ghalbzouri等 [41]用手術刀在皮膚（HSE）上制造全層損傷，部分創面給予外源性生長因子，觀察傷口上皮化的速度。實驗結果表明：表皮生長因子（EGF）的表達可以促進角質化細胞的遷移和增殖，進而加速傷口的上皮化過程。單細胞層傷口的愈合速度取決于細胞數量的增加。另有實驗表明：外源性的表皮生長因子(EGF)可以提高單個細胞的運動能力，促進單層傷口的愈合速度 [42]。

黃暉等 [38]發現，感覺神經肽P物質能明顯加速創面愈合速度，并具有誘導表皮干細胞向創緣集中和向創面肉芽組織中遷移的作用。付小兵等 [39]報道，表皮細胞生長因子可通過誘導皮膚干細胞增殖、分化而加速受創表皮再生；而經重組人表皮細胞生長因子治療的慢性皮膚潰瘍，在修復創面過程中，可見表皮棘細胞層有少量表皮干細胞島，初步認為可能是由成熟的表皮細胞逆分化而來，其中EGF是一個重要的誘導因素。這一結果不僅使人們對EGF促進創面愈合的機制產生了新認識，而且可能為將來利用表皮干細胞進行皮膚功能性修復提供了新思路。

除了外源性生長因子對于上皮化的促進作用，相關研究表明傷口附近的角質化細胞分泌的內源性生長因子和細胞因子可以加速傷口上皮化的過程。Myers等 [21]的研究認為，提高傷口處生長因子和細胞因子的表達水平，可以活化毛囊和表皮內的表皮干細胞，加快上皮化，最終促進傷口的愈合。

②利用表皮干細胞通過組織工程技術構建組織工程皮膚，覆蓋傷口以加速上皮化。

大面積燒傷患者，往往采用創面斷層皮片移植的方法覆蓋創面，以促進傷口愈合并減少瘢痕形成。但是自體取皮會造成供皮區損傷，而且還存在著供區不足的問題 [43]。利用患者自身的表皮細胞進行培養，形成連續的大張表皮之后，將其從培養皿上小心取下，直接覆蓋于燒傷或者潰瘍傷口表面 [44]，這種方法培養時間過長，而且培養獲得的表皮比較脆，表皮與傷口的粘附效果亦欠佳。利用組織工程技術，在體外將大量培養的表皮干細胞種植在富含成纖維細胞的膠原海綿表面，構建組織工程皮膚，并移植到裸鼠皮膚的全層傷口處覆蓋傷口，結果顯示，經此處理的傷口比未經處理的傷口愈合快，瘢痕也較輕微 [46]。

4　展望

隨著表皮干細胞研究的深入，應用表皮干細胞治療增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩有著廣闊前景，但是調節表皮干細胞分化的通路十分復雜，利用調節通路的方法實現創傷無瘢痕愈合等問題仍需更深入的研究。臨床應用前必須解決在體外快速、足量獲得干細胞的問題，將來能夠通過分離、純化表皮干細胞，精度調控其增殖分化以及關鍵信號通路等手段實現創面的無瘢痕愈合。