我國蘿卜分子生物學研究現狀與前景展望

王冰林 李媛媛 韓太利

（1.濰坊市農業科學院，山東濰坊，261061；2.濰坊學院生物工程學院）

我國蘿卜分子生物學研究現狀與前景展望

王冰林1李媛媛2韓太利1

（1.濰坊市農業科學院，山東濰坊，261061；2.濰坊學院生物工程學院）

概述了分子標記、基因克隆、基因定位、常用分子生物學技術體系優化等在蘿卜研究中的應用進展，并對現代分子生物學技術在蘿卜遺傳改良應用中存在的主要問題和應用前景進行了討論。

蘿卜 分子生物學 分子標記 基因克隆 基因定位

蘿卜起源于中國，在中國已有2 700多a的栽培歷史。我國蘿卜種質資源豐富，收集保存的蘿卜資源達2 000余份，各生態區域均有適合本地消費習慣和不同生長季節的傳統地方品種。蘿卜可菜用、生食和加工，主要食用部位為膨大的肉質根，富含多種維生素、礦物質、碳水化合物、粗纖維、木質素、淀粉酶及芥子油等有益成分，具有祛痰、利尿、止瀉等藥用功效，是我國人們喜愛的營養保健蔬菜之一，在蔬菜栽培和供應中占有重要地位，近年消費量呈明顯上升趨勢。長期以來，我國已在蘿卜品種選育、優質高產配套栽培技術、生理生化、組織培養、病蟲害防治等領域取得了顯著成績，但在現代分子生物學研究方面則相對滯后。近年來，隨著分子生物學技術在植物研究中的廣泛應用，我國在蘿卜分子標記技術、基因克隆、基因定位、常用分子生物學技術體系優化等方面取得了一定進展。

1 DNA分子標記技術

DNA分子標記具有數量豐富、遺傳穩定、便于操作等特點，并且能對各個發育時期的個體、組織、器官甚至細胞進行檢測，既不受環境影響，也不受基因表達與否的限制，所以建立在DNA基礎上的分子標記技術已廣泛應用于植物遺傳育種中。近年來，分子標記技術研究在蘿卜種質資源遺傳多樣性、種子純度與體細胞雜種鑒定等方面取得較大進展。2004年，孔秋生等[1]利用12個隨機引物，對來源于不同國家和地區的有代表性的56份蘿卜種質資源遺傳多樣性進行了RAPD分析，共擴增出109條帶，其中多態性帶72條，占62.9%。2005年，孔秋生等[2]又利用篩選出的8對引物對56份蘿卜種質的親緣關系進行了AFLP分析，共擴增出327條帶，其中多態性帶 128條，多態性位點百分率39.1%，表明栽培蘿卜種質資源存在較豐富的遺傳多樣性，為蘿卜種質資源的收集、保存、創新和有效利用提供了相關依據。分子標記還應用于蘿卜品種純度鑒定，2005年，任雪松等[3]利用80個隨機引物對胭脂蘿卜及雜株進行了RAPD分析，發現引物S50可在胭脂蘿卜和雜株的RAPD圖譜中形成多態性差異，可將其用于胭脂蘿卜種子的純度檢測。2007年，趙麗萍等[4]應用SRAP與AFLP兩種分子標記方法進行了蘿卜品種鑒定分析，供試材料均可被這兩種標記準確鑒定。另外，經過改良的AFLP技術——甲基化敏感擴增多態性（MSAP）被用于金屬鎘脅迫處理后蘿卜基因組DNA甲基化程度的變化研究，為從DNA水平上揭示重金屬毒害機理與植物對重金屬脅迫的反應機制提供了理論依據[5]。

2 基因克隆與異源表達

早在1992年，王燕平等[6]對心里美蘿卜抗病毒干擾素誘生劑有效成分dsRNA進行了克隆，并應用cDNA雜交法檢測了不同變種蘿卜dsRNA的親緣性。目前，蘿卜基因克隆及誘導表達研究主要體現在抗病相關基因上，并通過在大腸桿菌中異源表達進行功能驗證。抗菌肽是一類新型的抗菌物質，可以保護植物組織和種子不受真菌侵害。侯路珍等[7]采用RT-PCR方法，從蘿卜葉子中克隆到抗菌肽基因AFP，并在大腸桿菌中得以誘導表達，表明該基因在原核表達系統中能夠正常表達。2006年，劉金亮等[8]從表現紅心病的濰坊蘿卜塊根上得到一蕪菁花葉病毒分離物，通過RT-PCR獲得了該分離物的外殼蛋白基因，將該基因克隆到原核表達載體pET-22b（+）中，在大腸桿菌BL21中表達出分子量為38 kD的融合蛋白，Western blotting分析證明該基因在大腸桿菌中得到了正確表達。近年來，還有關于蘿卜雄性不育相關基因——細胞色素P450 CYP86MF基因、花粉發育相關基因RsMF2的克隆及其結構特征分析的報道[9～10]。

3 基因定位

蘿卜基因定位研究起步較早，但進展較慢。早在1989年，為了確定葉綠體DNA與花粉育性有關的特異片段位置，王虹等[11]利用蘿卜細胞質雄性不育系401A及其同核保持系401B為材料研究發現，蘿卜葉綠體DNA花粉育性相關的3個差異片段位于rRNA基因所在的葉綠體基因組反向重復區。1997年，熊玉梅等[12]對蘿卜葉綠體DNA進行了限制性酶切分析，將Rubisco大亞基基因（rbcL）定位在E11片段上，并構建了ctDNA EcoRⅠ基因文庫，為進一步研究rbcL基因的表達和篩選其他目的基因奠定了基礎。2008年，張紹松等[13]與德國合作，將野生油蘿卜抗甜菜胞囊線蟲基因定位于d染色體上，并且發現油蘿卜的9條染色體附加到油菜中后，其遺傳穩定性因附加的染色體而異，有的能穩定遺傳，有的在自交后代中丟失1條或2條。

4 常用分子生物學技術體系優化

PCR以及在PCR基礎上發展起來的RAPD、ISSR分子標記和mRNA差異顯示反轉錄PCR（DDRT-PCR）等是常用的分子生物學實驗技術，在動植物種質資源遺傳多樣性分析、基因圖譜構建、標記輔助選擇和基因差異表達等領域均得到廣泛應用。近年來，這些技術在蘿卜中也逐漸得以應用并不斷優化。張建軍等[14]以蘿卜基因組DNA為模板進行了RAPD-PCR反應體系優化研究，將正交試驗用于條件優化試驗以獲得優良反應體系。宋賢勇等[15]對影響PCR反應的主要因子——模板DNA、引物、dNTPs和Mg2+濃度進行了優化，建立了適合于蘿卜基因組DNA的RAPD和ISSR反應體系。隨機擴增微衛星多態性（RAMP）是一種RAPD和SSR相結合的新型分子標記，龔義勤等[16]對蘿卜基因組RAMP分析體系中的Mg2+，dNTPs和引物濃度進行了優化，并對7個蘿卜品種的遺傳多樣性和品種鑒定進行了RAMP標記分析。DDRT-PCR是一種鑒定基因差異表達的常用分析方法，2008年，賈晉等[17]以蘿卜幼嫩薹葉及花蕾為試材，探索了快速、高效的RNA提取方法；并以蘿卜花蕾為材料，對影響DDRT-PCR體系的5個關鍵因素進行了優化，得到了重復性好、適用范圍較廣的mRNA差異顯示反應體系。以上分子生物學技術體系的優化為從分子水平上研究蘿卜種質資源評價利用、品種鑒定、種子純度檢測、雄性不育遺傳機制與分子育種提供了重要的技術支撐。

5 其他

近年來，蘿卜分子生物學研究還體現在功能基因表達載體構建、調控序列分析等方面。2004年，馬春花等[18]利用基因工程技術構建了含有幾丁質酶、1，3-葡聚糖酶和蘿卜抗真菌蛋白的三價植物表達載體，并通過農桿菌直接轉化法將其轉入農桿菌EHA105，獲得陽性重組農桿菌工程菌株。蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因（RsPHGPx）編碼一個有生理功能的過氧化物酶，為深入了解該基因的表達調控機制，2005年，楊曉東等[19]采用DNA印跡、常規PCR與染色體步行法相結合的方法闡明了RsPHGPx基因的結構及其上游調控序列，這是首個關于植物PHGPx基因結構和上游調控序列的系統報道。

6 存在的問題與研究展望

目前，我國在蘿卜分子標記、基因克隆、基因定位等現代分子生物學研究領域已取得了一定進展，但尚處于起步階段，許多問題還有待于進一步研究和解決。例如，蘿卜分子標記技術多限于種質資源遺傳多樣性、種子純度與體細胞雜種鑒定等方面，而重要農藝性狀分子標記輔助選擇研究尚未深入開展，某些技術體系還處于探索階段；雖然基因克隆與基因定位研究較早，但進展緩慢，基因功能只能通過大腸桿菌異源表達進行驗證，而關于蘿卜遺傳轉化體系與功能基因實質性驗證等研究還未見報道。

隨著現代分子生物學理論與技術在不同物種、不同研究領域的快速發展與廣泛運用，今后在蘿卜遺傳改良和實際應用中可加強以下研究：應用DNA分子標記進行重要性狀輔助選擇；高密度遺傳圖譜的構建和重要性狀的基因定位；基因工程技術與種質創新利用；基因組研究；常規育種技術和現代生物技術有機結合促進優質、抗性育種研究等。高密度遺傳圖譜構建和重要性狀基因的精確定位，能夠促進蘿卜分子標記輔助選擇育種發展。利用植物基因工程技術，可以打破物種間界線，改良現有蘿卜品種和提供優異變異種質，加速優質、高抗蘿卜新品種選育。以上研究將提高蘿卜遺傳育種的目的性、精確性，縮短育種周期，提高育種效率。

[1]孔秋生，李錫香，向長萍，等.蘿卜種質資源親緣關系的RAPD分析[J].植物遺傳資源學報，2004，5（2）：156-160.

[2]孔秋生，李錫香，向長萍，等.栽培蘿卜種質親緣關系的AFLP分析[J].中國農業科學，2005，38（5）：1 017-1 023.

[3]任雪松，李成瓊，宋洪元，等.胭脂蘿卜種子純度的RAPD檢測研究[J].西南農業大學學報：自然科學版，2005，27（6）：837-839.

[4]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等.蘿卜品種指紋圖譜SRAP與AFLP分析[J].植物研究，2007，27（6）：687-693.

[5]楊金蘭，柳李旺，龔義勤，等.鎘脅迫下蘿卜基因組DNA甲基化敏感擴增多態性分析[J].植物生理與分子生物學學報，2007，33（3）：219-226.

[6]王燕平，陳愛君，張競，等.心里美蘿卜dsRNA的克隆和cDNA雜交法檢測不同變種蘿卜dsRNA的親緣性[J].病毒學報，1992，8（4）：364-366.

[7]侯路珍，劉發央，謝小冬.蘿卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大腸桿菌中的誘導表達[J].甘肅農業大學學報，2004，39（3）：245-248.

[8]劉金亮，于曉慶，田延平，等.濰坊蘿卜中蕪菁花葉病毒分離物的分子特性及CP基因的表達[J].園藝學報，2006，33（1）：84-88.

[9]王玲平，曹家樹，葉紈芝.蘿卜RsCYP86MF基因cDNA全序列克隆及結構特征分析[J].園藝學報，2005，32（1）：127-130.

[10]張濤，曹家樹.蘿卜花粉發育相關基因RsMF2的分子克隆與特性[J].中國農業科學，2005，4（7）：494-500.

[11]王虹，李繼耕，孔繁瑞，等.蘿卜葉綠體DNA花粉育性特異片段的定位[J].生物工程學報，1989，5（1）：40-45.

[12]熊玉梅，張西平，張效民，等.蘿卜葉綠體rbcL基因定位及ctDNA基因文庫的構建[J].武漢大學學報：自然科學版，1997，43（4）：532-535.

[13]張紹松，Peterka H，Budahn H，等.油蘿卜抗胞囊線蟲基因的染色體定位及其在油菜附加系中的穩定性[J].中國農業科學，2008，41（1）：93-101.

[14]張建軍，司龍亭，姜晶.優化蘿卜基因組DNA RAPD-PCR反應體系的正交設計法[J].植物生理學通訊，2006，42（2）：293-295.

[15]宋賢勇，柳李旺，龔義勤，等.蘿卜基因組DNA RAPD與ISSR-PCR反應體系優化[J].種子，2007，26（2）：1-5.

[16]龔義勤，李培，王明霞，等.蘿卜基因組DNA的RAMP-PCR體系優化[J].植物研究，2006，26（1）：93-97.

[17]賈晉，張魯剛.蘿卜DDRT-PCR技術體系的優化[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2008，36（4）：128-134.

[18]馬春花，周鵬，王華.幾丁質酶、葡聚糖酶與蘿卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因三價表達載體的構建及農桿菌工程菌株的重組[J].西北植物學報，2004，24（4）：570-577.

[19]楊曉東，劉進元.蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因結構及其調控序列分析[J].生物化學與生物物理進展，2005，32（7）：649-655.

Progress and Prospect of Molecular Biology in Radish in China

WANG Binglin1,LI Yuanyuan2,HAN Taili1
(1.Weifang Academy of Agricultural Sciences,Shandong 261061; 2.College of Biological Engineering,Weifang University)

The progress of molecular marker,gene cloning,gene mapping,and the system of molecular biotechnology in radish was reviewed in this paper.Meanwhile,the major problems and outlook about the applications of molecular biotechnology to genetic improvement in radish were discussed.

Radish;Molecular biology;Molecular marker;Gene cloning;Gene mapping

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.08.001

山東省中青年科學家科研獎勵基金（2007BSA07009）

王冰林（1972-），男，博士，副研究員，副院長，主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術研究，電話：0536-2118661，13583610349。E-mail:binglinwang@126.com

2008-11-13