大白菜ＰＨＫ４基因ｃＤＮＡ３′端序列的克隆及分析

任相亮　梁　丹　李　丹等

摘要采用3′RACEcDNA末端擴增技術，克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。該序列長810bp，其中編碼區序列546bp，編碼181個氨基酸，其編碼序列、氨基酸序列與擬南芥AHK4基因的同源性分別為90%和96%，說明PHK4基因與AHK4基因編碼區的同源性較高，而PHK4基因3′UTR區與AHK4基因3′UTR區的同源性為52%，遠低于編碼區。

關鍵詞大白菜；PHK4基因；3′RACE；克隆

中圖分類號Q785文獻標識碼A文章編號1007-5739（2009）01-0007-02

植物在生長發育過程中有多種復雜的信號系統來識別并應答外界環境刺激，蛋白磷酸化和去磷酸化是調節細胞內信號轉導的最重要的機制，這一過程由蛋白激酶催化。根據磷酸化依賴底物的特異性不同，可將蛋白激酶分為：絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和組氨酸激酶[1，2]。典型的雙組分信號系統是由組氨酸蛋白激酶和反應調節蛋白組成，當組氨酸激酶以某種方式感應到環境刺激后，其組氨酸殘基自身磷酸化，并將磷酸基團轉移到反應調節蛋白的天冬氨酸殘基上，進而引起下游的信號級聯反應來適應環境變化[3，4]。

細胞分裂素的信號轉導是通過雙組分信號系統進行的。在擬南芥中，該信號系統由感受細胞分裂素的雜合型組氨酸激酶型受體、磷酸轉移蛋白和應答調控蛋白組成[4]。目前已確認的擬南芥中的細胞分裂素受體有3個：AHK2、AHK3和AHK4，其中AHK4主要在根中表達，該基因突變后，植株會失去細胞分裂素對根伸長的抑制作用[5，6]，從而影響植物的正常生長。

大白菜因其營養豐富、種植簡便、產量高等特點，成為廣泛栽培且受人們喜愛的蔬菜之一。為了研究大白菜中細胞分裂素的信號轉導途徑的特點，筆者擬首先擴增出大白菜中與AHK4基因同源的細胞分裂素受體基因PHK4 （Pekinensis Histidine Kinase 4）的cDNA序列。RACE技術即快速cDNA末端擴增技術（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE），它利用PCR技術，由已知的cDNA序列擴增出完整、真實的cDNA5′和3′末端序列，該方法也被稱為錨定PCR或單邊PCR[7]。目前，RACE技術正逐步取代經典的cDNA文庫篩選技術，已成為獲得全長cDNA序列的一種重要手段[8]。本研究以本課題組從大白菜中克隆得到的一段PHK4基因的cDNA序列為基礎，利用3′RACE技術對該基因3′端未知序列進行擴增，獲得了大白菜PHK4基因的3′端真實序列，從而為進一步研究該基因的功能和應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1材料。大白菜AB-81。

1.1.2試劑。Trizol試劑購自上海英駿生物技術有限公司；dNTP Mixture，PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，RNArase Inhibitor，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，pMD19-T載體均購自TaKaRa公司。

1.1.3引物設計。參照AMBION公司的RACE試劑盒說明書，合成3′RACE Adaptor. Adaptor1和Adaptor2（見表1）；根據大白菜一段PHK4基因的cDNA序列設計特異性引物SP1和SP2，所有引物均在上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取。利用Trizol試劑一步法提取大白菜總RNA[9]。

1.2.2反轉錄合成cDNA。在200μLPCR管中加入大白菜RNA 6μL（50ng），3′RACE Adaptor 2μL（20μM），dNTP Mixture（10mM）1μL，加RNase Free H2O至10μL，混勻后70℃保溫15min，迅速在冰上冷卻2min；加5×Prime ScriptTM Buffer 4μL、RNArase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Prime ScriptTM Reverse Tran scriptase（200U/μL）0.5μL，加RNase Free H2O至20μL，混勻后42℃保溫1h；70℃處理15min，冰上冷卻，得到大白菜cDNA。

1.2.33′RACE擴增。按照AMBION RACE cDNA Ampli-fica tion Kit說明書操作步驟進行。先以Adaptor1和SP1為引物，進行第1輪PCR反應；再以Adaptor2和SP2為引物，進行第2輪PCR反應。

1.2.4PCR產物回收和測序。PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，連接到pMD19-T載體上，提交上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.5分析方法。用NCBI和MEGA軟件對核酸和氨基酸序列進行同源性分析，RNAdraw生物學軟件分析預測3′UTR的二級結構[10-12]。

2結果與分析

2.13′ACE擴增

用Trizol法提取大白菜總RNA，電泳結果如圖1所示。以大白菜的cDNA為模板，Adaptor1和SP1為引物，進行第1輪PCR反應；以第2輪PCR擴增產物為模板，Adaptor2和SP2為引物，進行第2輪PCR反應（如圖2），在800bp左右有1條特異性的條帶。將目的片段回收后，連接到pMD19-T載體上進行序列測定。

2.2大白菜PHK43′端編碼序列分析

將得到的序列去掉3′RACE Adaptor后，得到810bp的片段，用NCBI預測該序列的編碼區為546bp，編碼181個氨基酸。在NCBI數據庫中進行序列比對和構建系統樹表明（如圖3），與擬南芥AHK4基因的同源性最高，編碼區序列的同源性為90%，氨基酸序列的同源性為96%。由結果表明，可確定所得到的序列是PHK4基因的3′端序列。

2.3大白菜PHK4基因與擬南芥AHK4基因3′UTR區比較

將得到的大白菜PHK4基因的3′UTR區序列與擬南芥AHK4基因的3′UTR區序列比對，此二者的同源性僅為52%，遠遠低于編碼區核酸序列的同源性。大白菜PHK4基因和擬南芥AHK4基因3′UTR區的二級結構（如圖4）的預測圖看出，二者雖然有相似的地方，但大白菜3′UTR區的莖環結構的數量明顯少于擬南芥，這可能會影響mRNA的穩定性，從而在所屬植物中實施不同的調控策略[11]。

3結論與討論

在大多數情況下，一個新基因全長cDNA序列的獲得一般通過篩選cDNA文庫或RACE法。本研究利用實驗室已得到的大白菜PHK4基因的一段cDNA編碼序列設計引物，利用3′RACE方法克隆出大白菜PHK4基因cDNA3′末端序列。分析表明，該基因與擬南芥AHK4基因的核酸序列的同源性為90%，氨基酸序列的同源性為96%。因此，可利用這種同源性，參考擬南芥基因的序列信息設計引物，克隆出大白菜PHK4基因的片段，再結合RACE技術得到基因的全長序列。

3′UTR對mRNA表達的調控作用極其重要，它不僅能調控mRNA在體內的穩定性及降解速率，控制其利用效率，協助辨認特殊密碼子，而且還決定mRNA的翻譯位點及控制其翻譯效率[13]。從大白菜PHK4基因的3′UTR區的莖環結構的數量明顯少于擬南芥，而莖環結構與mRNA的穩定性有關，這會抑制特殊蛋白質的結合，進而影響轉錄后積累及翻譯位點的識別[14]。本研究利用3′RACE技術，擴增出大白菜PHK4基因的3′端序列，為以后研究該基因結構與功能的關系打下基礎。

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