植物苯丙氨酸解氨酶研究進(jìn)展

高　雪

摘要苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)是催化苯丙烷代謝途徑第一步反應(yīng)的酶，也是這個(gè)途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，對(duì)植物具有非常重要的生理意義。綜述了苯丙氨酸解氨酶的存在與分布、基本特性、生理代謝意義、抗病以及基因表達(dá)與調(diào)控等，為PAL在植物抗病的應(yīng)用上提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞苯丙氨酸解氨酶；生理作用；抗逆境；基因表達(dá)與調(diào)控

中圖分類號(hào)S661.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)01-0030-04

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，也是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。莽草酸途徑產(chǎn)生的莽草酸通過分枝酸、預(yù)苯酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙氨酸，從而進(jìn)入苯丙烷類代謝途徑，苯丙烷類代謝可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可以形成CoA酯，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿、苯甲酸酯糖苷等次生代謝產(chǎn)物[1，2]。一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都由該代謝途徑直接或間接生成。在生物次生物質(zhì)代謝中具有防紫外線傷害、抵抗病原體的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多種重要作用。該酶在不同組織中、不同的內(nèi)外因素調(diào)節(jié)下，含量水平及其基因表達(dá)的時(shí)空方式均有所不同。

1PAL的存在和分布

1961年Koukal和Conn首次在綠色植物大麥幼苗中發(fā)現(xiàn)了PAL，并進(jìn)行了分離純化[3]。隨著研究的深入，該酶已被固定化，用于工業(yè)化生產(chǎn)苯丙氨酸。至今，PAL已在所有綠色植物中發(fā)現(xiàn)，在真菌、細(xì)菌、藻類中也有存在。不同植物中PAL活性不同，在同一株植物的不同組織部位，PAL活性也不同。一般越嫩的部位PAL活性越高，如楊樹的幼葉、頂芽、幼莖中PAL活性最高，而老莖和成熟葉中PAL則較低[4]。

在細(xì)胞水平上，植物PAL主要分布在表皮下的細(xì)胞和維管組織細(xì)胞中；在亞細(xì)胞水平上，PAL定位于細(xì)胞質(zhì)和一些細(xì)胞器上，如葉綠體、白色體、線粒體、過氧化酶體、乙醛酸體等。Nakushima等進(jìn)行了PAL的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)部分PAL活性最高，電子顯微鏡觀察顯示，PAL分散在細(xì)胞的基質(zhì)中，定位在高爾基體囊泡和次生壁加厚層中[5]。

2PAL的基本特性

PAL是一種胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，酶蛋白是一種含有4個(gè)相同亞單位的寡聚體，氨基酸組成隨不同來源而異，如水稻PAL氨基酸組成中酸性氨基酸成分低于小麥、玉米和馬鈴薯，而中性及堿性氨基酸成分則高于后三者[6]。在酶活性部位具有脫氫丙氨酰基的親電中心。酶蛋白分子量一般在220～330 KDa，但不同來源稍有差異，如馬鈴薯PAL分子量為330KDa，玉米為306KDa，小麥和水稻PAL分子量分別為280KDa和230KDa[1]。不同來源的PAL最適pH值在8.0～9.5。如甘薯PAL最適pH值為8.5～9.5，水稻為9.2，小麥為8.8，與其氨基酸組成相一致[7]。

該酶的動(dòng)力學(xué)曲線不符合米氏方程，不規(guī)則，具有別構(gòu)酶的特征。大多數(shù)PAL的米氏常數(shù)(Km)在0.3×10^-4～1.5×10^-2mmoL/L，水稻PAL的Km為5.94×10^-4mmoL/L；而小麥PAL的Km有2個(gè)，分別為0.625×10^-4 mmoL/L和3.1×10^-4mmoL/L[1，6]。

3PAL對(duì)植物生理代謝的意義

植物的代謝分為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝。植物的次級(jí)代謝有多條途徑，苯丙烷類代謝途徑是其中很重要的一條。苯丙烷類途徑生成的黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的作用，所以PAL對(duì)植物的生理意義非常重大(見圖1)。

3.1在木質(zhì)化中的作用

在植物的木質(zhì)化組織中含有較高的PAL活性。Nakashima等用分離的百日草葉肉細(xì)胞研究了苯丙烷類代謝酶類與木質(zhì)素、管狀分子形成和細(xì)胞分化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在百日草細(xì)胞分化過程中，木質(zhì)素的合成及管狀分子形成與PAL活性的增加成正相關(guān)，細(xì)胞溶質(zhì)中的PAL活性在木質(zhì)化之前迅速上升，微粒體和細(xì)胞壁的PAL活性在木質(zhì)化期間快速增加[5]。

3.2在植物色素形成過程中的作用

花色素是植物花朵、果實(shí)和葉片顏色的重要組成部分，花色素等的合成可由苯丙烷類產(chǎn)物反香豆酰CoA經(jīng)過類黃酮途徑生成，該過程與PAL密切相關(guān)。如莧紅素是中央種子目植物所特有的色素，當(dāng)用白光、藍(lán)光或紅光照射尾穗莧黃化苗后，發(fā)現(xiàn)PAL活性均有不同程度地上升，并有莧紅素的積累[8]。有人通過調(diào)節(jié)PAL合成基因的表達(dá)，有效地改變了矮牽牛、煙草和菊花的花色[9]。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)有可能改變蘋果等果樹果實(shí)的色澤。

3.3在植物根瘤形成中的作用

苯丙烷類代謝產(chǎn)物經(jīng)類黃酮途徑可產(chǎn)生黃酮類化合物，這些化合物對(duì)根瘤菌有趨化作用，有些類黃酮化合物還可作為根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導(dǎo)物質(zhì)[10]。這些黃酮類物質(zhì)的含量與PAL活性存在著密切的關(guān)系，在根瘤菌的形成過程中常伴隨著PAL活性逐漸增強(qiáng)。

4PAL在植物抗逆境中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，許多植物在遭受寒冷、機(jī)械損傷、微生物侵染等逆境時(shí)，植物的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷類代謝被激活，PAL活性迅速上升。如柑橘果實(shí)受機(jī)械損傷后，果皮中PAL的活性明顯高于對(duì)照，且pal2、pal6基因的表達(dá)比對(duì)照明顯增強(qiáng)[11]。因此，PAL活性可作為植物抗逆境能力的一個(gè)生理指標(biāo)。

4.1PAL在植物抗病中的作用

PAL活性與植物抗病性密切相關(guān)，其活性可作為衡量植物抗病性的生化指標(biāo)之一。植物感染病原菌后PAL活性明顯升高，并表現(xiàn)出規(guī)律性的變化，即在侵染的最初幾小時(shí)，酶活性上升滯緩，隨后急劇上升，酶活高峰一般出現(xiàn)在侵染后的12～48ｈ，之后迅速下降。受病原物侵染后，不同抗性的品種(系)間PAL活性有明顯差異，抗病品系誘導(dǎo)產(chǎn)生的PAL活性遠(yuǎn)高于感病品系，且PAL活性越大，品種(系)抗病性越強(qiáng)。如張淑珍等在對(duì)疫霉根腐病菌毒素脅迫下不同大豆抗感品種PAL活性的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病大豆品種的根、莖和葉中PAL活性在病程的大部分階段都高于對(duì)照[12]。PAL參與植物抗病的機(jī)制和作用主要有如下幾點(diǎn)。

4.1.1參與植保素的合成。植保素是參與植物防御反應(yīng)的重要生理活性物質(zhì)之一，主要包括酚類植保素(綠原酸、香豆素和兒茶酚等)、異黃酮類植保素(豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黃素等)和萜烯類植保素，它們能直接防止病原物的生長(zhǎng)發(fā)育和侵染。其中，前兩類都是苯丙烷類代謝的直接或間接產(chǎn)物，其生成量與PAL活性成正相關(guān)[1]。當(dāng)用PAL抑制劑Ｌ-2-氨氧基-3-苯丙酸和α-氨氧基-乙酸處理植物幼苗，植物體內(nèi)植保素合成和累積受到抑制[13]。

4.1.2參與木質(zhì)素的合成。木質(zhì)素可加強(qiáng)細(xì)胞壁，增加組織木質(zhì)化程度，形成病原菌入侵的機(jī)械屏障，木質(zhì)素的合成也來自苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸。PAL是這條途徑的第一個(gè)也是最重要的酶。研究表明，在植物-病原物互作中，PAL參與木質(zhì)素合成和累積。如棉花受枯萎病菌侵染后，隨著PAL活性提高， 出現(xiàn)木質(zhì)素的積累。PAL受抑制，木質(zhì)素合成亦受到抑制[14]；不同抗病性的杉木接種炭疽菌后，PAL比活力均上升，且抗病性強(qiáng)的杉木PAL比活力比抗病性弱的杉木高[15]。

4.1.3參與酚類物質(zhì)的合成。酚類化合物也是苯丙烷類代謝產(chǎn)物。PAL活性增高與酚類物質(zhì)的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黃瓜組織中，伴隨PAL活性升高，總酚積累[16]；在用多糖組分處理后，提高紅豆杉中酚類物質(zhì)和可溶性蛋白含量的同時(shí)，過氧化物酶和PAL的活性也被激活[17]。

4.2PAL與植物抗蟲性的關(guān)系

關(guān)于PAL參與植物抗蟲方面的研究報(bào)道較少，但關(guān)于苯丙烷類代謝途徑與植物抗蟲性的報(bào)道已有很多，主要集中在這一代謝途徑的產(chǎn)物(木質(zhì)素、植保素)與植物抗蟲性的關(guān)系方面。木質(zhì)素的積累，可使細(xì)胞壁加厚，成為食草類動(dòng)物取食的機(jī)械障礙，而植保素對(duì)草食性昆蟲具有毒害作用和趨避作用，這些化合物的生成與PAL含量存在著間接的關(guān)系。許多試驗(yàn)證明，PAL活性高低與植物的抗蟲性有很大關(guān)系，如吳龍火等在研究5種山羊草對(duì)禾谷縊管蚜取食的誘導(dǎo)性抗性機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，PAL酶活提高率與蚜蟲取食誘導(dǎo)有關(guān)[18]。而且食草類動(dòng)物的取食也可誘導(dǎo)PAL活性升高[19]。

5植物PAL基因的表達(dá)與調(diào)控

5.1植物PAL基因的克隆

完整的Rhodotorula toroloides PAL基因序列已有報(bào)道(Genebank/M18261)。1987年，Anson等從R.toruloides中克隆出了PAL基因，測(cè)得了其核苷酸全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)R.toruloides PAL基因有6個(gè)內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)基因上游有一段富含C+T的序列，這與脈孢菌(Neurospora)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的某些基因具有相似性，而在S.cerevisiae中這段富含C+T序列在一些高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要的作用[20]。這提示PAL基因中這段富含C+T序列對(duì)表達(dá)的意義，有利于PAL基因工程菌的構(gòu)建。同時(shí)，Anson歸納出了編碼R.toruloides PAL基因的密碼子的使用頻率[20]。這對(duì)從cDNA(DNA)中擴(kuò)增PAL基因時(shí)設(shè)計(jì)PCR引物具有重要的參考價(jià)值。迄今為止，對(duì)植物PAL基因的研究最多，已有多種植物的PAL基因序列已經(jīng)測(cè)定并公布在GeneBank中。

5.2植物PAL基因的表達(dá)調(diào)控

對(duì)苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控包括酶的內(nèi)部調(diào)節(jié)和外界因子調(diào)控兩個(gè)方面。它們的表達(dá)受發(fā)育和環(huán)境信號(hào)的調(diào)節(jié)，具有嚴(yán)格的組織時(shí)間特異性[1]。

5.2.1植物體內(nèi)對(duì)PAL酶的內(nèi)部調(diào)節(jié)。PAL酶活性隨植物發(fā)育過程的推進(jìn)而不斷變化。一般PAL酶活性最初較低或沒有，后上升到一個(gè)高峰后下降，達(dá)到高峰的時(shí)間不同植物有所不同，如水稻9d、小麥7d、胡蘿卜60h。植物體內(nèi)有一種內(nèi)源性抑制物質(zhì)(PAL-inhibitor， PAL-I)參與PAL活性的調(diào)節(jié)。從去胚乳的水稻黃化苗中提取并部分純化了PAL-I，它是非透析的蛋白質(zhì)，大部分活性可被蛋白酶破壞，具有熱穩(wěn)定性。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，PAL-I對(duì)PAL的抑制是競(jìng)爭(zhēng)性的。水稻PAL-I不僅能抑制水稻PAL，還能抑制從小麥、玉米、馬鈴薯中提取的PAL，但不能抑制水稻中提取的其他酶類，如多酚氧化酶[21]。研究還發(fā)現(xiàn)，單子葉植物幼苗胚乳中普遍存在PAL內(nèi)源抑制物質(zhì)的調(diào)節(jié)因子(PAL-inhibitor-regulator， PAL-IR)，去胚乳后，內(nèi)源抑制物質(zhì)增加，幼苗中PAL活性下降。目前認(rèn)為胚乳對(duì)幼苗PAL活性的調(diào)節(jié)作用在禾本科植物中具有普遍意義，而雙子葉植物子葉對(duì)PAL的調(diào)節(jié)作用不具有普遍性，要比單子葉植物的胚乳復(fù)雜的多[1，21]。

PAL酶除自然降解、鈍化因子和調(diào)節(jié)因子外，還受其末端產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。酶抑制劑有許多種類，如肉桂酸、ρ-香豆酸、α-氨氧基乙酸和一些氨基酸如組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。不同來源的PAL對(duì)同一種類抑制劑的敏感性不同。如來源于大麥和紅酵母的PAL對(duì)硫氫基類抑制劑敏感，而來源于馬鈴薯、玉米、黑粉菌和鏈霉菌的則不敏感，這種對(duì)酶活性的抑制同酶活性部位脫氫丙氨酰基的喪失和減少相伴隨，其機(jī)理可能是對(duì)脫氫丙氨酰殘基的修飾[7]。

5.2.2外界因子對(duì)PAL酶的調(diào)控。PAL是一種誘導(dǎo)酶，可受多種因素的誘導(dǎo)。低溫、機(jī)械損傷、光(白光、藍(lán)光、紅光、紫外光)、病原菌感染、毒素處理、昆蟲取食、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、懸浮細(xì)胞的稀釋和外源植物激素等因素都可以在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)PAL基因的表達(dá)［22，23］。如用真菌誘導(dǎo)子接種歐芹葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，接種后6～8h，PAL mRNA在大范圍內(nèi)高度表達(dá)，且明顯高于對(duì)照；約12h后，PAL mRNA收縮到壞死斑周圍，并在此區(qū)域內(nèi)，PAL酶蛋白有所增加；接種25h，PAL mRNA表達(dá)基本恢復(fù)到原來水平，而PAL酶蛋白在壞死斑周圍被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)合成[24]。

生長(zhǎng)素(IAA)、激動(dòng)素(BAP)和乙烯都可誘導(dǎo)植物PAL基因的表達(dá)，剌激效應(yīng)乙烯＞IAA＞BAP。還有研究表明，赤霉素(GA3)也能誘導(dǎo)PAL活性的升高[1]。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中以及受病原菌及其誘導(dǎo)物和傷害等刺激時(shí)，PAL常伴隨內(nèi)源乙烯合成的增加而積累。如在西瓜果實(shí)發(fā)育中，PAL基因隨著乙烯生物合成基因的表達(dá)而表達(dá)[25]；馬鈴薯在用外源乙烯處理后，PAL mRNA的水平增加[26]。說明乙烯可能是植物PAL誘導(dǎo)表達(dá)的內(nèi)源信號(hào)分子。各種誘導(dǎo)因子間還存在著互作關(guān)系，如在切傷誘導(dǎo)甘薯塊根切片PAL活性增高時(shí)，IAA、BAP和乙烯處理能使PAL的活性再增加，BAP的效應(yīng)還可被照光而增強(qiáng)[7]；在尾穗莧黃化苗PAL與莧紅素積累的相關(guān)性研究中，也觀察到光對(duì)BAP的刺激作用有增效現(xiàn)象[8]。

5.3調(diào)控機(jī)理

PAL是由一個(gè)多基因家族控制，不同組織有多種PAL同工酶，分別定位于不同的組織細(xì)胞，控制不同的代謝途徑[1，7]。研究表明，植物PAL基因結(jié)構(gòu)的普遍特點(diǎn)是由小的多基因家族組成，在1組染色體中，含有1至多個(gè)PAL基因，并隨不同植物而異，基因內(nèi)一般含有1個(gè)內(nèi)含子。如菜豆基因組包含3 個(gè)PAL基因，即PAL1、PAL2、PAL3。它們都可在根部大量表達(dá)，而花瓣中PAL2大量表達(dá)，PAL1表達(dá)量很少，PAL3不表達(dá)；這3個(gè)PAL基因都能被機(jī)械損傷誘導(dǎo)，而PAL1和PAL2能被真菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)。此外，在機(jī)械損傷的細(xì)胞和木質(zhì)部細(xì)胞都能檢測(cè)到PAL2的活性[27]。這與其生理功能一致，因?yàn)樵谀举|(zhì)部的正常發(fā)育過程中，木質(zhì)部的形成也是從PAL所催化的反應(yīng)開始的。植物細(xì)胞受傷時(shí)用于填補(bǔ)傷口的物質(zhì)的合成也需要PAL。

PAL多基因家族在表達(dá)上的差異是由于它們的啟動(dòng)子所包含的順式作用元件不同而引起的。由順式作用元件和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子共同作用，控制PAL基因在不同時(shí)間和組織中的表達(dá)。植物PAL基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)調(diào)控也說明了這一點(diǎn)。有人將菜豆(PAL2、PAL3)、擬南芥(PAL1)等植物PAL基因的啟動(dòng)子與β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase，GUS)報(bào)告基因融合轉(zhuǎn)移到馬鈴薯、煙草、擬南芥中，通過檢測(cè)報(bào)告基因活性，來研究PAL啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)調(diào)控模式及表達(dá)的細(xì)胞和組織特異性。他們發(fā)現(xiàn)用親和性的Pseudomonas solanacearum野生型菌株K60，或不親和性的無毒性突變株B1，接種含有擬南芥PAL1-GUS基因融合物的轉(zhuǎn)基因煙草植株，迅速誘導(dǎo)了GUS基因的大量表達(dá)[28]；將菜豆PAL2-GUS和PAL3-GUS轉(zhuǎn)入擬南芥、馬鈴薯和煙草中，其表達(dá)受環(huán)境刺激因子的誘導(dǎo)調(diào)控，也受轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育階段調(diào)控，表現(xiàn)出不同的時(shí)空表達(dá)模式[28]。GUS表達(dá)的組織化學(xué)分析表明，菜豆PAL基因啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和煙草的特定細(xì)胞——機(jī)械損傷的細(xì)胞中表達(dá)，也可在發(fā)育中的木質(zhì)部(射線細(xì)胞)和花器中表達(dá)[29]。這些結(jié)果表明，PAL基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，也受病原菌、轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育階段及其他環(huán)境因子的誘導(dǎo)調(diào)控。

6結(jié)語

PAL是植物次生代謝中一種非常重要的酶類，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病反應(yīng)等過程中起著非常重要的作用。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，大量PAL基因的克隆、測(cè)序、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析及時(shí)空表達(dá)模式的研究，將為在轉(zhuǎn)基因植物中大量、持久表達(dá)PAL酶，提高次生代謝產(chǎn)物的含量，增強(qiáng)植物對(duì)病害的廣譜持久抗性及其他農(nóng)藝性狀具有非常重要的作用。同時(shí)深入研究PAL基因啟動(dòng)子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以進(jìn)一步闡明PAL基因的調(diào)控機(jī)理，還能為增強(qiáng)作物抗病性、作物的遺傳改良等研究開辟新的思路，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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