趨化劑對細胞偽足極性生長的影響研究

鄒珍友　黃　艷　王　勇　張　慧　戴　威　許露露　程彥偉　汪素美

摘要為了解趨化性細胞逆趨化劑濃度梯度遷移的機理，用帶有熒光標記的趨化劑(FITC-LPS)誘導了培養的中性粒細胞。發現中性粒細胞在靠近趨化劑的一側的熒光比背離趨化劑一側的熒光強，并朝趨化劑方向長出偽足移動。細胞在迎、背趨化劑兩面與趨化劑結合濃度的差異導致細胞微絲組裝的部位差異可能是造成偽足生長密度差異的原因，這一差異決定了細胞趨化運動的方向。

關鍵詞中性粒細胞；趨化劑；偽足

中圖分類號Q813.6文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)01-0268-01

趨化性是細胞朝可溶性化學刺激物移動的一種現象。一些真核細胞，如白細胞、神經膠質細胞、內皮細胞、骨髓細胞、肝癌細胞、平滑肌細胞等在體內均有明顯的趨化現象，趨化運動時細胞可在體表任何部位形成臨時性的細胞質突起(偽足) 作為運動器而移動[1，2]。

中性粒細胞在體內受細菌感染時，細菌表面的內毒素即脂多糖可成為一種趨化劑，使中性粒細胞發生趨化變形穿出毛細血管集聚到細菌侵犯的部位，吞噬細菌細胞，在胞質內形成吞噬體。再被各種水解酶、過氧化物酶、溶菌酶及其他具有殺菌作用的蛋白質、多肽等成分殺死并分解消化[3-5]。

對于細胞趨化運動的啟動，細胞逆趨化劑濃度梯度運動的機理，目前了解的不是很清楚，為此筆者用標有熒光劑的趨化劑LPS誘導中性粒細胞產生趨化運動，顯示趨化劑在細胞迎、背趨化劑面與趨化劑結合濃度的差異，以及細胞在兩面生成偽足的大小、密度不同，觀察這些差異與細胞向趨化劑方位移動的關系。

1材料與方法

1.1試驗材料

小鼠6只，購自南京醫科大學；PVP，南京阿恩地公司生產；復方泛影葡氨、肝素，廣州治藥廠生產；脂多糖L2880、異硫氫酸熒光素，美國Sigma公司生產。

1.2大腸桿菌培養與提取LPS

無菌條件下，接種大腸桿菌于LB培養基中，置搖床37℃過夜培養。從搖床上取出菌液，3 000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用10mL蒸餾水混勻，置65～68℃水浴，加入等體積預溫的苯酚，激烈攪勻，加熱5min，冰浴，迅速降溫至10℃以下。3 000rpm離心30min，取上清液，透析除酚并濃縮，20 000rpm超速離心10min，取上層透明膠狀部分，懸浮于水中，冷凍干燥得到粉末狀LPS。

1.3抽提小鼠中性粒細胞與電鏡觀察

取5月齡小鼠，腹腔注射PVP-泛影葡胺溶液2mL后放回籠中過夜，誘導生成中性粒細胞。向小鼠腹腔注射0.5 mL水合氯醛麻醉后，剪開腹部表皮(注意不要弄破腹腔膜)，吸取腹水，在超凈臺加入Hanks液，2 000rpm離心5min，棄上清液得中性粒細胞。用2.5％戊二醛將中性粒細胞混勻，固定10h，用蒸餾水清洗后滴在樣品臺上自然干燥，然后鍍金，放在掃描電鏡下觀察。

1.4細胞培養及細胞趨化

1.4.1平板打孔趨化試驗。在培養皿中倒上培養基，待冷卻后在中間打一孔加LPS，間距8mm打四周孔，孔內加培養的中性粒細胞。然后置細胞培養箱中 5％ CO2 培養5h。最后在倒置顯微鏡下觀察中性粒細胞向中心孔移動情況。

1.4.2用熒光劑FITC標記LPS。將4mg LPS加入0.5％三乙胺2mL內，0℃攪拌20min，使LPS雙鏈離解為單鏈結構。用1moL/L的鹽酸10μL將其pH值調為5，然后加入含5mg FITC的0.1moL/L磷酸鈉溶液1.5mL(pH值9.5)，并在37 ℃下攪拌孵育3h，孵育后，在4℃下將其混合物與磷酸鈉溶液徹底離心后，去上清液即得帶FITC熒光標記的LPS。

1.4.3熒光顯微鏡下觀察中性粒細胞與趨化劑不均勻的結合。在載玻片上先滴加幾滴1640培養液，加入中性粒細胞。試驗組的玻片一端加入50μL的熒光標記的LPS趨化劑，置CO2 培養箱培養，5h后用濾紙小心沿玻片上的液體吸干，用細胞培養液小心清洗幾次，切勿將細胞漂起擾動極性。清洗完畢，吸去玻片上的殘液，置熒光顯微鏡下用綠色濾光片觀察。

2結果與分析

在顯微鏡下，對照組的中性粒細胞呈圓形；用無熒光標記的趨化劑處理的中性粒細胞呈不規則形狀，有一端有類似片足的結構。FITC-LPS趨化的中性粒細胞在熒光顯微鏡下可看到大部分細胞迎趨化劑一端熒光較亮并有較多突起，背趨化劑一端較暗并較圓滑(見圖1、圖2)。

3討論

趨化劑與細胞表面的受體結合引起F-actin組裝的信號通路激活，最后通過質膜部位的WASP蛋白激活Arp2/3復合物，導致肌動蛋白的聚合。本試驗揭示了細胞逆趨化劑濃度梯度遷移的初步機理。即趨化劑在擴散空間形成的濃度差異，使細胞不同部位的表面結合趨化劑數量有差異，在細胞迎趨化劑面結合的趨化劑比背面多，誘導F-actin組裝的信號物質激活較多，導致細胞在趨化劑一面F-actin的聚合比背離趨化劑那面多，結果使細胞在靠近趨化劑一面伸出形成大量含微絲的偽足，Myosin-Ⅱ(肌球蛋白)介導的收縮引起細胞尾部收縮，兩方面的作用和變化最終導致了細胞逆趨化劑方向產生方向性運動[6，7]。

運用FITC熒光材料標記趨化劑LPS，不僅保留了LPS的活性，同時使LPS帶有熒光，用它誘導培養的中性粒細胞趨化性移動，可通過觀察細胞不同部位的熒光強度，從而判斷中性粒細胞與趨化劑結合的方位與細胞移動方向的關系。

4參考文獻

[1] 張秀真，吳澤志.細胞偽足形成與微絲骨架研究進展[J].國外醫學(臨床生物化學與檢驗學分冊)，2005，26(4)：213-216.

[2] 朱大年.生理學(第七版)[M].北京：人民衛生出版社，2008.

[3] 嚴尉峰.醫學免疫學[M].北京：人民衛生出版社，2001.

[4] 周正任.醫學微生物學(第六版)[M].北京：人民衛生出版社，2007.

[5] 李燕，牟伯中.細菌趨化性研究進展[J].應用與環境生物學報，2006， 12(1)：135-139.

[6] 翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學(第三版)[M].北京：高等教育出版社，2007.

[7] 袁春華.fMLP誘導中性粒細胞極性及其機制研究[D].廣州：南方醫科大學，2007.

[8] 李鵬，邢杰.中性粒細胞的分離與純化[J].醫學理論與實踐，2005，18(3)：272-274.