青錢柳提取物清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用

[摘要] 目的 研究五種青錢柳提取物(CPS)清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用。方法 采用組織勻漿MDA比色法測定不同濃度的CPS對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用。利用Fenton 反應產(chǎn)生#8226;OH，研究CPS對羥自由基的清除作用，計算半清除率(IC50)。結(jié)果 五種提取物均明顯的具有抗脂質(zhì)過氧化作用，在濃度為1.0 mg#8226;ml-1時，對小鼠肝組織自發(fā)性MDA的抑制率大小為:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。CPS對#8226;OH自由基IC50大小為:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。結(jié)論 五種青錢柳提取物均有較強的體外抗氧化活性，且活性與濃度呈明顯的量效關系。

[關鍵詞] 青錢柳;提取物;脂質(zhì)過氧化;自由基

文章編號:1003-1383(2009)04-0381-03

中圖分類號:R 963

文獻標識碼:A

青錢柳[Cyclocarya paliurus(Batal) Iljinskaya](CPS)又名青錢李(江西)，系雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬植物，它是我國獨有珍稀樹種資源[1]，分布于廣西、江西、浙江等地的山區(qū)、溪谷或石灰?guī)r山地，為廣西特色植物。據(jù)《中國中藥志要》記載，其樹皮、樹葉具有清熱解毒，止痛功能，可用于治療頑癬。長期以來民間用其葉片做茶，因其味甜有清熱解暑、降糖、降壓的功效，又稱為甜茶，神茶等[2]。青錢柳干葉的主要成分有糖、氨基酸、有機酸、黃酮、酸性物質(zhì)、內(nèi)酯、香豆精、三萜及皂甙、甾醇等[2]。我國從1970年開始對青錢柳進行藥用開發(fā)研究，發(fā)現(xiàn)青錢柳具有明顯的降血糖、降血壓、減肥、抗腫瘤、抗衰老、抗過敏、清熱解暑、提高人體免疫力、促進新陳代謝等多種功效，尤其對治療糖尿病有顯著療效[3]。本實驗對青錢柳不同提取物的體外抗氧化性進行了研究，為更進一步開發(fā)青錢柳保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2.實驗材料與儀器 青錢柳采自廣西陽朔縣白沙鎮(zhèn)青錢柳基地，752GW型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)、FA2004電子天平(上海精科天平)、小型三用水箱(北京醫(yī)療設備廠)、XHB型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、LD0.8離心機(北京醫(yī)用離心機廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52型，上海亞榮儀器廠生產(chǎn))。

3.試劑 丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、蒸餾水、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫均為分析純，PBS液為自制。



4.實驗方法

(1)青錢柳不同溶劑提取物的制備 取烘干過篩的青錢柳粉末，分別按固液比1∶20加入去離子水，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器提取2 h，過濾，去殘渣。濾液分兩部分，一部分加入80%乙醇提取后再用水提取，利用水提醇沉淀法[4]用三氯醋酸去蛋白質(zhì)后得到青錢柳多糖合物，另一部分加入80%乙醇，提取1.5 h，分別用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，得正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物，最后剩余的為水提物。各提取物均用真空濃縮至膏狀，并于40℃真空干燥，冷藏備用。

(2)CPS對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響 小鼠禁食12 h后摘除眼球放血處死，取肝，在0~4℃下用生理鹽水制成5%肝勻漿。實驗分為對照組(10%肝勻漿)、陽性組(VitC)和高、中、低3個劑量的青錢柳提取物組(10%肝勻漿和青錢柳不同溶劑提取物配液)。以硫代巴比妥酸法測定MDA含量，并計算抑制率:

抑制率(IR)=(對照組MDA-提取物組MDA)/對照組MDA。

(3)CPS對羥自由基的清除作用

采用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生(#8226;OH)的方法。在樣品管中加0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 ml，PBS 2 ml和1 ml樣品，旋渦混合器混勻后，加0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 ml，旋渦混合器混勻后，加0.01%過氧化氫溶液1 ml，置恒溫水浴中37℃保溫1 h。反應液置比色皿中，于分光光度計中在536 nm測定吸光度As。用1 ml蒸餾水代替1 ml樣品，測定吸光度為Ap。吸光度為Ab的管不加過氧化氫和樣品，都以蒸餾水代替。按以下公式計算羥自由基的清除率(d%):d%=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100。

5.統(tǒng)計學處理 計量資料以均數(shù)±標準差(-±s)表示，采用EXCEL統(tǒng)計軟件以t檢驗進行統(tǒng)計學處理，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.CPS對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響 青錢柳各提取物對MDA的生成均有抑制作用，隨著各提取物濃度增加，部分提取物的抑制率也會相應增高。五種提取物中對MDA抑制最強的為正丁醇提取物，在濃度為1.0 mg#8226;ml-1時，對小鼠肝組織自發(fā)性MDA的抑制率大小為:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。見表1。

表1 CPS對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響(-±s，n=6)

組別濃度(mg#8226;ml-1)MDA(nmol#8226;mgprot-1)抑制率(%)

對照組 11.388 ±0.306

VitC1.06.831±0.221※40.0

正丁醇提取物0.18.826 ±0.405※22.5

0.56.522 ±0.385※42.7

1.05.646 ±0.363※50.4

水提物0.19.742 ±0.164※14.5

0.58.715 ±0.325※23.5

1.07.844 ±0.386※31.1

多糖合物0.18.652 ±0.368※24.0

0.56.788 ±0.386※40.4

1.07.257±0.383※36.3

乙酸乙酯提取物0.18.531 ±0.459※25.1

0.58.848 ±0.317※22.3

1.08.528 ±0.388※25.1

石油醚提取物0.19.284 ±0.315※18.5

0.57.488 ±0.243※34.2

1.07.081 ±0.571※37.8

注:與正常對照組比: ※P<0.01

2.CPS對羥自由基的清除作用 CPS對#8226;OH有清除作用，且作用較強。特別是正丁醇提取物、水提物和多糖合物，最高清除率可高達80%以上。隨著各提取物濃度的增加，對#8226;OH自由基的清除率不斷增大。但到了一定濃度，再增加其濃度，反而清除率有所降低。

半清除率(IC50)指清除率為50%時所需樣品的濃度，根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出。所需濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好。通過計算所得IC50值，可比較各青錢柳提取物對羥自由基的清除率:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。見表2。

表2 CPS對#8226;OH自由基的清除作用(-±s，n=6)

觀察項目水提物

石油醚提取物

正丁醇提取濃度(mg#8226;ml-1)0.020.050.100.150.300.250.300.400.050.100.15

0.300.50

清除率(%)33.7±1.243.1±1.552.5±0.961.0±1.294.5±1.741.3±0.753.9±1.675.7±1.2

3.0±0.99.2±1.719.0±01.641.7±1.290.4±1.2

IC50(mg#8226;ml-1)0.09

0.29

0.31

(續(xù))表2

觀察項目多糖合物

乙酸乙酯提取物

濃度(mg#8226;ml-1)0.300.400.500.600.700.800.900.250.300.350.40

清除率(%)44.3±0.955.0±00.762.4±1.171.0±60.780.0±0.987.8±0.983.9±1.218.6±0.9

40.1±1.247.7±0.721.6±1.2

IC50(mg#8226;ml-1)0.33

0.35

討論

青錢柳為廣西特有珍稀植物，對它的開發(fā)利用還十分有限，青錢柳既有明顯的藥理價值又具備一定的食品保健功能，進行工業(yè)化開發(fā)利用前景十分廣闊。針對青錢柳葉中含有黃酮、多糖、內(nèi)酯等多種有效成分，本實驗提取了五種青錢柳提取物，考察青錢柳的體外抗氧化活性，為其藥理作用提供科學依據(jù)。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛等可導致人體細胞氧化損害、老化、致癌和動脈硬化等多種疾病。過氧化脂質(zhì)大部分由肝細胞產(chǎn)生，其分解也主要在肝臟。MDA是過氧化脂質(zhì)的主要降解產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度。故MDA的水平測定可用作檢測抗過氧化作用。本實驗結(jié)果表明，CPS可明顯降低小鼠自發(fā)性MDA的生成，且活性與濃度有明顯的量效關系。

羥自由基是反應藥物抗氧化活性的重要指標。本實驗利用Fenton反應產(chǎn)生羥自由基:H2O2+Fe2+=#8226;OH+OH+Fe3+。Fe2+與鄰二氮菲生成紅色配合物，加入CPS后，減弱了#8226;OH對Fe2+/鄰二氮菲的氧化作用，引起自由基的變化，通過測定其吸光度值的變化，推斷CPS對#8226;OH的作用。結(jié)果表明CPS對羥自由基有較好清除作用，是天然高效的自由基清除劑。

CPS較高的體外抗氧化活性可能與其中含有黃酮類化合物有關。黃酮類化合物具有的多酚結(jié)構，能提供活潑質(zhì)子，與自由基結(jié)合成穩(wěn)定的產(chǎn)物，因而有較強的抗氧化作用[5]。黃酮類成分具有保肝、擴冠、抗炎、降低血管脆性，解除痙攣，增強心臟收縮，還有一定程度的抗菌及抑制腫瘤細胞等作用。同茶葉相比，青錢柳黃酮類化合物含量相對較高，可作為這些物質(zhì)的補充源[6]。

參考文獻

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].第21卷.北京:科學出版社，1979，18-19.

[2]謝明勇，李 磊.青錢柳化學成份和生物活性研究概況[J].中草藥，2001，32(4):365-366.

[3]柳板譽，梁彥蘭.混交林中青錢柳生長規(guī)律的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2004，26(3):381-385.

[4]王著祿，陳海生，鄭欽岳，等.商陸多糖的分離和純化[J].第二軍醫(yī)大學學報，1990，11(1):56.

[5]張培剛，鄭鴻雁，昌有權，等.松針黃酮的體外抗氧化作用研究[J].食品科學，2005，26(9):506-508.

[6]謝明勇，王遠興，溫輝梁，等.青錢柳中黃酮甙和維生素含量的測定[J].食品科學，2001，22(1):66-68.

(收稿日期:2009-05-18 修回日期:2009-07-15)

(編輯:梁明佩 英文審校:唐雄林)