ＴＰ－ＥＬＩＳＡ一步法在檢測梅毒螺旋體抗體中的鉤狀效應分析

[摘要] 目的 分析梅毒螺旋體抗體酶聯免疫吸附試驗(TPELISA)雙抗原夾心一步法檢測梅毒螺旋體抗體中出現的鉤狀效應，探討其對檢測結果的影響以及避免措施。 方法 TPELISA雙抗原夾心一步法檢測結果為陰性的10份可疑標本，分別用雙抗夾心二步法、稀釋法和梅毒特異性抗體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測。結果 10份用TPELISA雙抗原夾心一步法檢測結果為陰性的可疑標本，用雙抗原夾心二步法檢測時結果全部轉為陽性;TPPA檢測結果為陽性而且效價均大于1∶1280;標本經倍比稀釋后，分別采用TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法進行測定，用一步法在1∶2和1∶4時分別有4例和2例測定結果仍為陰性，稀釋度在1∶512范圍內檢測結果均為陽性; TPELISA一步法測定結果的吸光度隨著血清稀釋倍數的增加，吸光度值逐漸增加達高峰，后吸光度逐漸減小，曲線呈“鐘形”;二步法則曲線在開始的時候維持在高值并無太大變化，而后隨稀釋倍數增加吸光度值逐漸下降，曲線呈倒“S形”。結論 TPELISA一步法在檢測梅毒螺旋體特異性抗體中存在“鉤狀效應”，用稀釋法或者兩步法可以避免該效應。 

[關鍵詞] 梅毒螺旋體;鉤狀效應;酶聯免疫吸附試驗 

文章編號:1003-1383(2009)04-0421-03

中圖分類號:R 446.61

文獻標識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.023

梅毒是由梅毒螺旋體(TP)感染引起的疾病，以性傳播為主，也可以通過血液及母嬰等形式傳播。因此，對獻血員、產婦、輸血患者進行梅毒螺旋體感染的實驗室檢查具有非常重要的意義。我們選取10份臨床可疑標本進行檢測，就TP

ELISA中的“鉤狀效應”產生的原因和避免措施進行探討。

材料和方法

1.血清標本來源本院住院和門診病人中臨床癥狀和病史疑似梅毒，血清TPELISA一步法檢測陰性，TPPA試驗檢測陽性的標本10例。

2.試劑和儀器 TPELISA梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒為上海科華生物工程公司生產，TPPA試劑盒由日本富士瑞必歐株式會社提供。酶標儀和洗板機為雷杜公司的RT6000型和RT3000型。

3.方法 用TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法分別對樣本的原液及稀釋液進行檢測。一步法按試劑盒說明書操作;二步法用一步法試劑先加血清樣本，37℃孵育30分鐘，洗板，再加酶標抗體。TPPA檢測步驟按試劑說明書進行。

結果

1.用雙抗原夾心一步法檢測梅毒螺旋體特異性抗體陰性的10份可疑標本，用二步法檢測，結果轉為陽性;用TPPA檢測也均為陽性，而且其效價均大于1∶1280，見表1。

表1 不同檢測方法對樣本的檢測結果

標本號TPELISA一步法OD值結果

TPELISA兩步法OD值結果TPPA

10.056- 0.122+1∶1280

20.034- 0.290+ 1∶1280

30.028- 0.322+1∶2560

40.043- 0.117+1∶2560

50.021- 0.671+1∶1280

60.045- 0.338+1∶5120

70.026- 1.147+1∶1280

80.024- 0.416+1∶1280

90.063- 0.134+1∶2560

100.064- 0.734+1∶2560

注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:陽性;“-”:陰性

2.分別用雙抗原夾心一步法和二步法測定10份經過1∶2，1∶4…… 1∶2048倍比稀釋的標本，10份標本各稀釋度的吸光度(A)的均值見表2。兩種方法測定的吸光度值與血清抗體濃度的關系見圖1。用雙抗原夾心一步法測定不同稀釋度血清，吸光度值隨著稀釋倍數的增加逐漸升高，達到較高水平后又逐漸下降，曲線變化呈“鐘形”;二步法則吸光度值開始維持在高值并無太大變化，而后隨稀釋度增加而逐漸下降，曲線呈倒“S”形。

3.TPELISA一步法和二步法對不同稀釋度血清的抗體檢出情況比較 一步法的漏檢率呈兩極現象。見表3。

表2 TPELISA一步法和二步法檢測不同稀釋度血清的吸光度均值

稀釋度TPELISA一步法OD值結果

TPELISA二步法OD值結果

1∶20.012- 1.866+

1∶40.290+ 1.810+

1∶80.690+ 1.712+

1∶161.396+ 1.654+

1∶321.805+ 1.702+

1∶641.528+ 1.523+

1∶1281.151+ 0.789+

1∶2560.984+ 0.671+

1∶5120.416+ 0.447+

1∶10240.134+ 0.134+

1∶20480.077- 0.124+

注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:陽性;“-”:陰性

圖1 TPELISA雙抗原一步法和二步法檢測不同稀釋度血清的吸光度值變化曲線

表3 一步法和二步法對不同稀釋度標本的檢出情況

稀釋倍數一步法陽性(N)陰性(N)

二步法陽性(N)陰性(N)一步法漏檢率(%)

1∶1010 100100

1∶264 10040

1∶482 10020

1∶8100 1000

1∶16100 1000

1∶32100 1000

1∶64100 1000

1∶128100 1000

1∶256100 1000

1∶512100 1000

1∶102473 9130

1∶204864 8244

討論

目前，針對梅毒的血清學檢查主要包括TP特異性和非特異性抗體檢測。梅毒非特異性抗體檢測包括快速血清反應素環狀卡片試驗(RPR)和(TRUST)等;而對特異性抗體檢測方法有:梅毒螺旋體血球凝集實驗(TPHA)，TPPA，免疫印跡實驗(Western blot)，熒光密螺旋體抗體吸附實驗(FTAABS)及TPELISA等。TPPA，TPHA，免疫印跡，FTAABS雖然特異性很強，但因為成本較高，操作步驟煩瑣而不適合對于大批量標本的檢測。而ELISA法具有操作簡單、用時短、靈敏度高和成本低廉等優點而普遍被各醫療機構衛生防疫部門以及血液中心采用，作為大批量標本梅毒抗體的篩查方法。TPELISA是利用基因工程合成的梅毒抗原，通過雙抗原夾心法檢測梅毒特異性抗體[1]，主要包括TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法。TPELISA一步法因其具有操作簡單、反應快速、敏感性高、結果易于判斷及易于進行質量控制等優點被廣泛采用，逐漸取代了RPR，成為醫療衛生機構和血站的梅毒篩選方法。但是，由于TPELISA一步法檢測技術中“鉤狀效應”的存在，可以引起檢測結果假陰性。因此，如何避免“鉤狀效應”，減少陽性病例的漏診率成為目前研究的重點。

TPELISA法檢測梅毒特異性抗體的方法主要包括:雙抗原夾心法和間接法。雙抗原夾心法主要檢測梅毒特異性抗體IgG和IgM總抗體。雙抗原夾心一步法測定梅毒特異性抗體是最常用的方法。其原理是在同一個ELISA檢測體系中同時加入待測標本(含抗體)和酶標記抗原，形成的結合物包括:固相抗原+待測抗體(A)， 固相抗原+待測抗體+酶標抗原(B)，待測抗體+酶標抗原(C)，酶標抗原+待測抗體+酶標抗原(D)，在這4種結合物中，只有(B)結合物才是要測定的目的結合物。如果在反應體系中，待測的抗體濃度太高，由于競爭抑制作用，(C)和(D)類結合物增多，(B)類結合物減少，導致反應顯色降低，甚至不顯色，這就是所謂的“鉤狀效應”[2]。

在本研究中，通過采用TPELISA雙抗原夾心一步法、二步法及TPPA檢測10份可疑標本，結果表明，用雙抗原夾心一步法檢測為陰性的這10份標本，用二步法檢測均轉為陽性，TPPA檢測結果也均為陽性，而且滴度均達到1∶1280以上;將10份標本再進行倍比稀釋并同時用雙抗原夾心一步法和二步法同時進行檢測，稀釋度在1∶2和1∶4時，一步法檢分別有4例和2例檢測結果仍為陰性，其余稀釋度血清用雙抗原夾心一步法和二步法檢測，結果均為陽性，這說明了雙抗原夾心一步法對高濃度抗體標本的檢測是存在鉤狀效應的，而將存在鉤狀效應的標本經過稀釋后可以消除，但是稀釋的倍數要達到一定程度。通過對10份標本進行倍比稀釋度后，用雙抗原夾心一步法和二步法檢測，用各濃度血清吸光度值(A)的均值與血清稀釋度關系所做的曲線可看出，一步法在原倍及低稀釋倍數也就是標本中待測抗體濃度較高時，吸光度值低;隨著稀釋倍數的增加吸光度值反而逐漸增高，到最適比時達到最高值，而后又逐漸降低，吸光度(A)值變化曲線呈“鐘形”。而用二步法檢測，吸光度(A)一直維持在較高水平，而當稀釋度達一定倍數時，吸光度(A)值才逐漸下降，整個曲線呈倒的“S”形，這與蔣玉蓮，朱浩穩等的報道相似[3]。

雙抗原夾心二步法由于是抗體和酶標抗原分兩步加入，因此不存在競爭抑制作用，可以避免鉤狀效應的產生。在本研究中，我們利用一步法試劑，先加入血清標本，37℃孵育30分鐘，洗板后再加入酶標抗原，這樣建立起來的二步法測定經一步法檢測結果為陰性，而TPPA法檢測為陽性的標本，其結果全部轉為陽性，這說明了雙抗原夾心二步法可以避免鉤狀效應的產生。雖然二步法可以避免鉤狀效應的產生，但卻造成實驗的敏感性降低[4]，一些弱陽性標本會被漏檢。

雖然雙抗原夾心一步法在方法學上存在“鉤狀效應”的缺陷，但是由于其快速簡便節約時間的優勢，在我國仍然占據著很大的市場。為避免和消除鉤狀效應，我們可以用二步法、稀釋法及TPPA或RPR 等方法做為補充，對臨床一些可疑標本進行測定[5]。同時對于試劑廠家，應在固相和標記抗體或抗原的選擇匹配上，采取結合位點遠離或含多個可結合位點的方法，這樣在很大程度上，可以避免或減輕“鉤狀效應”;另外也可充分混勻反應液，適當延長反應溫育時間，則可使A、C和D復合物減少至最低程度，而減輕“鉤狀效應”的產生。 

總之，本研究結果表明，TPELISA一步法檢測梅毒特異性抗體存在鉤狀效應，在出現檢測結果和患者病史及臨床病表變現不一致的情況下，應該選擇其他方法進行確認。

參考文獻

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[5]李金明.感染性疾病血清學檢驗中應重視對弱反應性標本的確認[J].中華檢驗醫學雜志， 2006，29(7):577.

(收稿日期:2009-05-01 修回日期:2009-07-31)

(編輯:梁明佩)