腦紅蛋白的神經細胞保護機制研究概況

[關鍵詞] 腦紅蛋白;缺血缺氧;神經保護

文章編號:1003-1383(2009)04-0492-03

中圖分類號:R 338

文獻標識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.069

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氧是機體新陳代謝和維持生存的必要因素，人們很早就知道血紅蛋白(Hb)和肌紅蛋白(Mb)是機體氧的轉運與儲存、線粒體耗氧產能及清除多余氧等過程中的關鍵物質。而對高耗氧的腦組織，人們一直都未能發現能夠促進神經系統氧利用的關鍵分子。腦紅蛋白(Ngb)是德國科學家Burmester T等[1]在2000年首次發現的存在于人和小鼠腦組織內，功能上類似于肌紅蛋白的攜氧球蛋白。含量雖低，僅占腦組織蛋白的0.01%左右[1]，但與腦的氧供應密切相關，在分子水平上調節腦組織氧的供應狀態，近年來逐漸成了神經科學研究的熱點。國內外學者對其做了較為深入的研究，現就腦紅蛋白的分子結構、在機體中的分布及功能和相關研究進展作一簡要介紹。

一、腦紅蛋白的結構

腦紅蛋白主要以單體形式存在，由151個氨基酸組成，相對分子量為17KD，有少量腦紅蛋白為多聚體，主要為二聚體，極少為四聚體，二聚體以二硫鍵相連。在生理狀態下Ngb以還原狀態即脫氧形式(F8His2+-E7His)存在，其結構為6配體，人和小鼠 Ngb是球蛋白當中第一個具有6個配體的單體蛋白[2]。Ngb與Hb、Mb均為含鐵卟啉的蛋白，但在基因組成和蛋白結構等方面與Hb、Mb有較大差異。Ngb基因在高級脊椎動物中是一種高度保守的基因，序列同源性分析表明，大鼠和小鼠Ngb基因序列同源性為96%，與人類Ngb同源性為88%，但與脊椎動物其他球蛋白則有很低的同源性，與Mb序列一致性<21%，與Hb一致性<25%。國內張成崗等[3]用RTPCR法首先克隆了Ngb基因，人Ngb基因約長8041bp，放射原位標記發現人Ngb位于14q24染色體上。Ngb具有獨特的外顯子和內含子結構，有4個外顯子和3個內含子，其中3個內含子分別位于B122、E110、和G70，與 Hb、Mb比較，E110為其獨特的內含子，該基因的啟動子區域含有幾個潛在的轉錄因子SP1的結合位點。同時Ngb還具有經典螺旋三折疊結構特性[4]，基本結構是一個血紅素結構和蛋白質肽鏈。

二、腦紅蛋白的分布

腦紅蛋白廣泛存在于動物器官組織中。在哺乳動物中，目前已經在小鼠、大鼠和人中發現了Ngb，Burmester等[1]用Northern雜交和原位雜交技術證實腦紅蛋白在小鼠和人腦組織中腦前葉、下丘腦和丘腦等處表達最強。鄧美玉等[5～6]用原位雜交及免疫組化技術分析發現，Ngb mRNA陽性細胞廣泛存在于大鼠腦內各個區域，定位于神經元細胞質內。Ngb免疫反應物質在腦中不同區域表達水平不同，大腦皮質表達水平較高，海馬區、丘腦、下丘腦均有散在分布。小腦中陽性細胞較強，主要分布于浦肯野細胞。在腦干、腦橋中也觀察到陽性細胞分布，但較少。Schmidt等[7]還觀察到Ngb在小鼠的視網膜中大量表達，其密度大概是大腦中的100倍，主要分布在視網膜中耗氧最多的視細胞外網層、內網層及節細胞層中，提示Ngb參與了高耗氧的視覺感受和視覺形成過程。王航雁等[8]研究發現，人體不同組織中除腦組織中表達相對較高外，在多種組織中都有表達，胎腎、人肝等組織Ngb mRNA表達甚至大于大腦皮質、全腦和小腦，說明Ngb基因并不是神經系統特異性的，可能在機體許多組織、臟器中廣泛區域發揮作用，這很可能與多種組織氧利用有密切關系。此外，內分泌系統如垂體、胰島的Langerhans細胞、腎上腺中也有表達。

三、腦紅蛋白的生物學功能

腦紅蛋白的生物學功能目前尚不完全清楚，可能與下面幾方面有關:①在氧代謝方面有類似Mb的功能。儲存氧氣和促進氧氣向線粒體擴散或直接介導氧氣向線粒體的傳遞，促進ATP的產生，從而維持正常神經元的功能。Ngb 能夠可逆性地結合氧，與氧氣有很高的親和力，半飽和壓力(P50)約為2托(torr)，高于哺乳動物Hb(約為26托)，低于Mb(約為1托)，該特性使得即使血氧濃度較低，也十分有利于轉運氧氣通過血腦屏障，提高高耗氧的腦組織中氧的利用率。實驗表明Ngb在缺血缺氧狀態下表達增加，且高度表達的Ngb能夠使培養的神經元在缺氧情況下存活率升高和急性缺血狀態下大鼠腦梗死體積縮小[9]，提示Ngb在腦缺血缺氧性損傷中對神經元有保護作用。目前缺氧誘導Ngb表達上調的機制仍未闡明，可能與缺氧誘導轉錄因子HIF1有關[10]。②氧氣感受功能。結合配體時6配位珠蛋白血紅素袋的構象變化較大，提示Ngb可能作為氧氣感受器，根據氧氣濃度的變化參與細胞內信號傳導通路調節[11]。③NADH氧化酶作用。在半缺氧條件下促進糖酵解，產生ATP供給能量，有助于維持神經元的正常功能。④作為活性氧和NO基團的清道夫，參與NO的代謝過程，從而減輕其對神經系統的損傷。

四、腦紅蛋白與缺血缺氧性疾病

目前較多研究表明Ngb對腦缺血缺氧有保護作用，這方面研究可以分為兩大類，一類是在缺血缺氧條件下觀察到在體或離體神經細胞腦紅蛋白的表達升高，因此推測它起到腦保護作用。另一類是在缺血缺氧條件下人為增強或降低腦紅蛋白的表達，觀察到在體或離體神經細胞損傷減輕或增加，這類實驗被認為具有較強的說服力。Sun等[9]通過向大鼠腦室注入脫氧核苷酸，中動脈閉塞后腦梗死面積增加，再給予表達Ngb的腺病毒載體后與對照組比較梗死灶體積減少50%，而利用反義寡核苷酸技術減少其Ngb的表達時，腦梗死體積較對照組增加了60%。另外，用NgbTAT治療培養的大鼠皮質神經元細胞可以降低細胞對氧的敏感性[12]，說明其可能在氧化應激誘導細胞損傷中起保護作用。過分表達Ngb的轉基因小鼠實驗也發現可以降低腦梗死體積[13]。還有實驗將小鼠大腦中動脈結扎90 min后再灌注4～24 h，發現神經元胞質內Ngb的表達量也增加。以上實驗表明Ngb在缺血缺氧情況下對腦組織具有保護作用。張成崗[14]等采用RTPCR技術對大鼠缺血缺氧損傷時腦組織中 Ngb mRNA水平的變化進行動態研究，發現該基因表達顯著升高，并呈時相變化，雙側總動脈夾閉1 min后腦組織中Ngb mRNA迅速增至高峰，5 min時仍然保持高水平，15 min時迅速降低，此后又緩慢升高，提示Ngb可能在腦缺氧適應性調節中起到重要作用。以往Ngb的研究主要集中在模型和動物實驗方面，在臨床應用研究方面目前還處于探索階段。最近國內王航雁等[15～16]用ELISA方法檢測新生兒血清Ngb，觀察新生兒和早產兒動脈血清中Ngb表達的變化，并探討其臨床意義，發現Ngb表達無性別差異，并初步確定了足月健康新生兒血清Ngb的參考范圍。研究還發現宮內窘迫新生兒血清Ngb表達水平顯著高于健康對照組，認為新生兒臍動脈血清 Ngb水平作為HIE的早期檢測指標具有臨床應用價值，該實驗為Ngb在臨床應用方面的研究提供了新的思路。Ngb在成人神經系統性疾病的臨床應用研究尚未見報道。

五、腦紅蛋白與創傷性腦損傷

目前多個研究顯示在腦缺血缺氧時Ngb的表達升高，表明了Ngb對缺血缺氧性腦損傷有保護作用，是否對創傷性腦損傷也有保護作用呢?近年來也有學者在這方面做了一些研究。國內周定標等[17]通過體外培養原代神經元損傷模型的建立，采用免疫組化和圖像分析技術觀測損傷前、后不同時間點神經元Ngb免疫組化反應物和陽性信號值，結果發現，12 h后Ngb陽性信號開始增加，16 h達到高峰，隨后逐漸下降，128 h后恢復正常水平，表明機械損傷可以誘導神經元Ngb在一定時間段內表達上調，Ngb可能參與了機械損傷后神經元的修復過程。研究還表明，大鼠彌漫性顱腦損傷后Ngb mRNA的表達呈雙峰型，提示其可能參與神經元損傷后應激及繼發性腦缺血缺氧性腦損傷的應答機制[18]。同樣，大鼠腦外傷后在傷灶周圍皮質神經元內也觀察到Ngb表達明顯升高[19]。以上研究表明，Ngb可能參與了腦外傷后神經元的保護作用。眾所周知，繼發性腦損傷的實質是腦組織的缺血缺氧，尸檢發現，腦外傷死亡的病人90%都存在腦缺血，改善腦外傷病人預后的關鍵在于抑制原發性腦損傷后的繼發性腦缺血缺氧損傷，腦紅蛋白的發現，為繼發性腦損傷的研究與防治提供了新的思路。

六、腦紅蛋白與其他疾病

作為一種新發現的攜氧球蛋白，因為腦紅蛋白的特殊分子結構和其對氧有很高的親和力，以及Ngb的神經元定位和可能的內源性神經保護因子的功能，為神經系統氧的利用及神經元保護等方面的研究提供了一條新的途徑，目前成為神經內科、神經外科以及機體組織氧利用方面研究的熱點，并取得了一定的成果。對其他疾病也具有保護的作用，有研究認為，腦紅蛋白在視網膜、生殖系統中的高濃度表達，為視神經缺氧性病變如高原眼底病、男性不育的治療方面指出了新的方向，具有重要的臨床意義[20]。近來研究還發現腦紅蛋白在神經系統退行性變中具有保護作用，與某些老年神經系統疾病的發生和發展有著某種聯系[21]，這些發現為帕金森氏綜合征、阿爾茨海默病等的治療帶來了新的希望。Fordel等[22]研究發現Ngb還可以保護細胞免受非缺氧性損傷，提示它可能還有更為廣泛的內源性作用。雖然Ngb已成為目前神經科學研究的熱點，并在基因序列、定位、蛋白結構等方面進行了較為深入的研究，但當前仍然存在幾個問題:①Ngb的生理功能目前還存在爭議;②Ngb到底是通過何種方式、如何對神經元實施保護;③Ngb受缺氧誘導所涉及的信號傳導途徑仍然不明了;④Ngb的相關臨床應用研究少見有報道。

綜上所述，Ngb是一種新的內源性神經保護因子，在神經系統疾病及組織氧利用等方面的研究具有重要的應用價值，對于Ngb保護神經細胞機制的研究及在臨床上如何加以利用是未來Ngb研究方向。

參考文獻

[1]Burmester T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature，2000，407:520-523.

[2]Tren JT 3rd，Watts RA Hargrove Ms.Human neuroglobin，ahexacoordinate hemoglobin that revevsiby binds oxygen[J].Biol chen，2001，276:30106-30110.

[3]Zhang C， Wang C， Deng M，et al. Full-length Cdna cloning of human neuroglobin and tissue expression of rat neuroglobin[J].Biochem Biophys Res commun.2002，290:1411-1419.

[4]Pesce A， Dewilde S，Nardini M，et al.Human brain neuroglobin structure reveals a distinct mode of controlling oxygen affinity[J].structur，2003，11(9):1087-1095.

[5]鄧美玉，張成崗，王航雁，等.腦紅蛋白mRNA在大鼠腦內的定位[J].解剖學報，2003，34(1):85-89.

[6]鄧美玉，張成崗，李 林，等.用免疫組化方法檢測腦紅蛋白在大鼠中樞神經系統的分布[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2003，11(3):271-274.

[7]Schmidt M，Giessl A，Laufs T，et al.How does the eye breathe?Evidence for the neuroglobin-mediated oxygen supply in the manmalin retina[J].J Biol Chem，2003，278(3):1932-1935.

[8]王航雁，鄧美玉，王 靜，等.腦紅蛋白基因在人體不同組織中的表達[J].實用兒科臨床雜志，2004，19(4):278-280.

[9]Sun Y，Jin K，Peel A，et al.Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(6):3497-3500.

[10]Sun Y，Jin K，Nao XO，et al.Neuroglobin is up-reglulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15306-15311.

[11]Kriegl JM，Bhattacharyya AJ，Nienhaus K，et al.Ligand binding and protein dynamics in neuroglobin[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(12):7992-7997.

[12]Zhou G Y，Zhou S N，Loi Z Y，et al.Translocation and neuroprotective properties of transactivator-of-transcription protein-transduction domain-neuroglobin fusion protein in primary cultured cortical neurons[J].Biotehonl Appl Biochen，2008，49(Pt1):25-33.

[13]Khan AA，Wang Y，Sunn Y，et al.Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia[J].Proc Natl Acad Sic USA，2006，103(47):17944-17948.

[14]鄧美玉，張成崗，王春麗，等.大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織中腦紅蛋白基因表達的變化[J].中華病理學雜志，2002，31:261-262.

[15]王航雁，王 靜，王 萍，等.腦紅蛋白在新生兒血清的表達及臨床意義[J].中華圍產醫學雜志，2007，10(2):121-122.

[16]王 靜，王航雁，王 萍，等.宮內窘迫新生兒血清腦紅蛋白的變化[J].實用兒科臨床雜志，2009，24(2):104-105.

[17]劉開東，周定標，尚愛加，等.體外培養原代神經元損傷模型的建立及損傷后腦紅蛋白的表達[J].中國微侵襲神經外科雜志，2008，13(2):68-70.

[18]林 欣，周定標，尚愛加，等.大鼠彌漫性顱腦損傷后腦紅蛋白mRNA變化的實驗研究[J].中國微侵襲神經外科雜志，2007，12(5):221-224.

[19]馮興軍，周定標，尚愛加，等.大鼠腦外傷后傷灶周圍皮質腦紅蛋白的表達變化[J].解放軍醫學雜志，2008，33(5):543-545.

[20]秦豪杰，武 娜，張錄順，等.腦紅蛋白在成年男性生殖系統的表達意義[J].解剖學雜志，2008，31(3):348-350.

[21]Sun Y，Jin K，Mao X O，et al.Effect of aging on neuroglobin expression in rodent brain[J].Neurobiol Aging，2005，26(2):275-278.

[22]Fordel E，Thijs L，Martinet W，et al.Dewilde，Neuroglobin and cytogloin overexpression protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death[J].Neurosci Lett，2006，410(2):146-151.

(收稿日期:2009-04-20 修回日期:2009-07-09)

(編輯:崔群飛)