環介導等溫擴增技術在臨床檢測中的應用

[摘要] 目的 探討環介導等溫擴增技術在臨床檢測中的應用。方法 采用我院2008年10月門診或住院患者85份試驗用的含結核桿菌的陽性痰液和陰性痰液，通過染色涂片鏡檢和經典PCR的方法及使用改良羅氏培養法進行培養予以定性，并與LAMP法檢測結果比較。結果 LAMP法與培養法、Amplicor MTB PCR法檢測痰液中結核分枝桿菌的陽性率無明顯差異。結論 LAMP法是一種新型的核酸擴增方法;由于它是近年來興起的一種技術，是一種便捷、特異性強和靈敏度高的快速基因檢測技術。

[關鍵詞] 環介導等溫護增技術;臨床檢測

[中圖分類號] R446.1 [中圖分類號] A[文章編號] 1673-9701(2009)24-43-02

日本學者Notomi等[1]于2000年發明了一種全新的核酸擴增方法——環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothemal amplifi cation LAMP)，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應[2]。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，該技術的問世解決了基于核酸的分子生物學檢測技術的諸多難題，使其作為快速診斷方法成為可能.，已經被廣泛用于細菌、病毒和寄生蟲等的檢測，動物胚胎性別鑒定，食品衛生檢疫及基因芯片的開發等，我們采用LAMP法對痰液中和培養基中的結核分枝桿菌進行檢測，并分析報道如下。

1材料與方法

1.1試驗樣本

試驗用的含結核桿菌的陽性痰液和陰性痰液來自選自我院2008年10月門診或住院患者85份，全部樣本均通過染色涂片鏡檢和經典PCR的方法及使用改良羅氏培養法進行培養予以定性。

1.2主要試劑

Bst DNA聚合酶與Tai I限制性內切酶購自英國Biolabs公司，三甲銨乙內酯(Betaine)購自瑞士Fluka公司。硫酸鎂購自美國Sigma公司，SYBR染料購自美國Invitrogen公司，DNA標志物購自北京天根生化科技有限公司，脫氧核苷三磷酸(dNTP)購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.3統計學方法

采用SPSS 11.0統計學處理軟件，P<0.05為差異具有顯著性。

2LAMP反應DNA引物的設計利用

ICBgyrB數據庫及RIDOM數據庫尋找結核分枝桿菌基因序列(GenBank accession No.CP000611)利用軟件選取結核分枝桿菌的特異性序列，該序列利用PrimerExplorerlV軟件進行進一步分析，設計1套6種引物分別是前外引物B3、后外引物F3、前內引物FIP、后內引物BIP、環狀引物LF及I，B，上述引物識別目標基因序列中的8個特定區域。所有引物由上海賽百勝基因技術有限公司合成。25ulLAMP反應體系:FIP和BIP各1.6pmol/L， F3和B3各0.2μmol/L， 1.4mmol/L dNTPs、 1.0mol/L Betaine、6.0mmol/LMgSO4、0.8mmol/L甜菜堿，2mmol/L dNTP，65℃反應60min，80℃5min終止反應，LAMP擴增產物取5μl，在質量分數為2%的瓊脂糖凝膠進行進行電泳分析，同時LAMP擴增的每個管中加入1.0μl 20×Smartgreen熒光染料混勻，在紫外燈(302nm)下顯影。

3結果

見表1，結果表明，LAMP法與培養法、Amplicor MTB PCR法檢測痰液中結核分枝桿菌的陽性檢出率無明顯差異(P> 0.05)。

4討論

LAMP是一種嶄新的DNA擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。LAMP原理[3]:引物的設計:基于靶基因3’端的F3c，F2c 和F1c區以及5’端的B1，B2和B3區等6個不同的位點設計4種引物。FIP引物:上游內部引物，由F2區組成，F2 區與靶基因3’端的F2c區域互補，與靶基因5’端的F1c區域序列相同。F3引物:上游外部引物，由F3區組成，并與靶基因的F3c 區域互補。BIP引物:下游內部引物，由B2區組成，B2區與靶基因3’端的B2c區域互補，與靶基因5’端的B1c區域序列相同。

DNA在65℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。反應中鏈置換型DNA聚合酶，能使后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈，在其作用下，以FIP引物砣區段的3’末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動復制一條新鏈。F3引物與靶DNA的F3c序列雜交，又通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，開始靶DNA互補鏈的合成，同時置換出FIP引物合成的DNA鏈。被置換出的DNA鏈在5’末端存在互補的Flc和F1區段，能發生自我堿基配對，形成環狀結構。同時這條單鏈DNA，又可作為模板，在另一端結合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈，并置換出一條單鏈DNA。此時，被置換的單鏈DNA兩端都存在互補序列，自我堿基配對后整條鏈呈現啞鈴狀結構，該結構是LAMP擴增循環的起始結構[4]。在啞鈴結構中，以3’末端的F1區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。同時，FIP引物上的砣與環上的F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應。其置換出的單鏈核酸也會形成環狀結構，BIP引物上的B2與環狀結構上存在的B2c雜交，啟動又一輪擴增。反應終產物是花椰菜樣的莖一環結構DNA組成的混合物，即由在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構[5]。

LAMP具有許多迄今為止的擴增方法無法比擬的優點:(1)只需一恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性。(2)高特異性:應用6個區段，4種引物，并且這6個區段的順序也有規定。原理上LAMP擴增的特異性很高，因此可以根據是否擴增就能判斷目標基因的存在與否，即能夠進行細菌或病毒的定性檢測。(3)快速、高效擴增:整個擴增在不到lh即可完成，且產率可達到0.5mg/mL。若在引物上再進一步改進，可大大提高其擴增效率，擴增時間在原來的基礎上減少1/3~1/2。(4)靈敏度高:擴增模板可達10拷貝或更少。(5)步驟簡單:擴增RNA只要在DNA基因擴增試劑的基礎上加上逆轉錄酶，就能夠完全像DNA基因擴增那樣，一步實現RNA擴增。(6)鑒定簡便:在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性，只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能判斷擴增與否，缺點只能有2種結果:擴增和不擴增。靶序列長度控制在300bp以下，一旦產生非特異性擴增，則不易鑒別[6]。

通過本組數據觀察，LAMP法與培養法檢測痰液及Amplicor MTB PCR法中結核分枝桿菌結果比較，數據檢測無明顯差異，(P>0.05)，進一步說明LAMP法檢測準確性和適用性，由于結核分枝桿菌的培養周期較長，使用羅氏培養基進行培養所需時間長達幾個月[7]，不利于結核分枝桿菌的快速檢測。PCR所需要的一系列變性、退火、延伸等復雜程序，使用擴增反應在恒溫的條件下進行，沒有DNA的變、復性過程，節省了大量時間;同時減少DNA大片段聚合酶與擴增核酸的污染機會;需要的試驗設備大大簡化。

總之，LAMP法是一種新型的核酸擴增方法;它是近年來興起的一種技術，是便捷、特異性強和靈敏度高的快速基因檢測技術。

[參考文獻]

[1] Notom T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research，2000，28(12):63.

[2] 蔡哲鈞，馮杰雄. 環介導等溫擴增技術及在傳染性疾病檢測中的應用[J]. 國際流行病學傳染病學雜志，2006，33(5):343.

[3] 汪一帆，郭潮潭. 環介導等溫擴增技術及在感染病診斷中的應用[J]. 中國衛生檢驗雜志，2008，18(9):1933.

[4] Kimura H， Ihira. M， E nomoto Y， et al. Rapid detection of herpes sim-plex virus DNA in cerebrospinal fiuid: comparison between loop -mediated isothermal amplification and real-time PCR[J]. Med Microbiol Immunol(Berl)，2005，194(4):181-185.

[5] Parida M， Posadas G’Inoue S， et al. Real-time reverse transcription loop -mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus[J]. J Clin Microbiol，2004，42:257-263.

[6] 蔡哲鈞. 核酸環介導等溫擴增技術[J]. 國際檢驗醫學雜志，2006，27(12):1092-1093.

[7] van der VIiet RA. Schukkink B， van Gemen，et a1. Nucleicacid sequencc-based amplification(NASBA) for the identification of mycobacteria[J]. J Gen Micrebiol，1993，139:2423-2429.

(收稿日期:2009-03-23)