多重ＰＣＲ檢測社區(qū)獲得性肺炎患者中的病原體

[摘要] 目的 評價多重PCR在快速診斷社區(qū)獲得性肺炎病原體中的作用。方法 提取痰液標(biāo)本中的DNA，擴(kuò)增病原體DNA后電泳并觀察其結(jié)果，同時給予普通PCR或分離培養(yǎng)作為對照。結(jié)果 成功檢測出32例感染者，與普通PCR符合率達(dá)100%，敏感性高于分離培養(yǎng)。結(jié)論 多重PCR能高通量、快速診斷病原體，值得臨床進(jìn)一步推廣。

[關(guān)鍵詞] 多重PCR；社區(qū)獲得性肺炎；病原體

[中圖分類號] R563.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701（2009）12-57-02

Detection of Pathogens in Patients with Community-acquired Pneumonia by Multiplex PCR

HE XinpingLIUJingfangTAN Huimin

Department of the Elderly Officials，Changsha Central Hospital， Changsha 410007

[Abstract] Objective To observe the rapid diagnosis value of multiplex PCR in patients with community-acquired pneumonia. Methods DNA was extracted and amplified from sputum. Common PCR or separation cullture was used as control. Results Pathogens were amplified from 32 patients，compared with common PCR，the coincidence was 100%，but the sensitivity was higher than separation cullture. Conclusion Multiplex PCR is a high-flux，repid method for clinical diagnosis of pathogens.

[Key Words] Multiplex PCR； Community-acquired pneumonia； Pathogen

社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）是指在醫(yī)院外罹患的感染性肺實(shí)質(zhì)（含肺泡壁，即廣義上的肺間質(zhì)）炎癥，包括具有明確潛伏期的病原體感染而在入院后潛伏期內(nèi)發(fā)病的肺炎[1]。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷包括分離培養(yǎng)以及PCR。然而對于部分難以培養(yǎng)的病原體如肺炎支原體，常規(guī)的方法難以達(dá)到快速診斷的目的，普通PCR也存在監(jiān)測通量低等問題[2]。本文采用多重PCR（multiplex PCR）就2006～2008年來我院住院的CAP患者進(jìn)行了相應(yīng)比較研究，旨在對多重PCR的臨床應(yīng)用作出初步評價。

1材料與方法

1.1材料

Tag酶，dNTPs，PCR緩沖液，引物合成等均來自上海生物工程有限公司；DNA抽提試劑盒購自QiaGen公司；PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；普通肉湯葡萄糖培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基購自上海美季生物技術(shù)有限公司。其余所有生化試劑均為分析純。

1.2病例選擇及標(biāo)本來源

本研究所采用的76例痰標(biāo)本均來自本院住院的CAP患者，所有患者肺部感染的符合中華醫(yī)學(xué)會2006年制定的《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男性44例，女性32例，年齡41～74歲，平均52.5歲。痰標(biāo)本分別來自上述76例患者，均為清晨清潔口腔后的一口來自肺深部的痰，所有患者取材前2w內(nèi)均未接受抗菌藥物治療。

1.3方法

1）檢測肺炎球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體和流感嗜血桿菌的多重PCR引物信息見表1[4]。20μl反應(yīng)體系中加入標(biāo)本DNA 2μL，擴(kuò)增方案為：94℃變性10min，然后94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，共40循環(huán)。最后一循環(huán)，72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。所有病原體同時通過普通PCR做對照。判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增產(chǎn)物條帶電泳位置與Marker電泳位置相同者為該菌陽性。2）細(xì)菌培養(yǎng)：痰標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后接種于普通培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基上，37℃孵育24～48h行革蘭染色及有關(guān)生化反應(yīng)鑒定。

2結(jié)果

2.1 多重PCR與普通PCR檢測結(jié)果

多重PCR與普通PCR檢測結(jié)果完全一致。痰標(biāo)本同時進(jìn)行多重PCR和普通PCR檢測，兩者均檢測出肺炎球菌14例，肺炎衣原體2例，肺炎支原體5例，流感嗜血桿菌11例，其中有25份標(biāo)本為以上4種菌的混合感染。多重PCR與普通PCR的符合率達(dá)100%。

2.2多重PCR與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較

76份標(biāo)本中經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)法分離出肺炎球菌11例，流感嗜血桿菌8例。其分離的敏感性略低于多重PCR法。多重PCR檢測以上4種菌陰性的44例患者中無一例培養(yǎng)陽性。

3討論

CAP是威脅人類健康的常見感染性疾病之一，病原學(xué)往往十分復(fù)雜，通常為混合感染。因此，精確的病原學(xué)診斷不僅是確診的重要依據(jù)，也是合理選擇治療方案的基礎(chǔ)。目前病原學(xué)檢查主要以培養(yǎng)為主，但通常需要耗時達(dá)3d左右，而且操作繁瑣，影響因素多。相對而言，分子生物學(xué)技術(shù)如PCR，在時耗、敏感性及特異性方面均具有分離培養(yǎng)無法比擬的優(yōu)勢，但面對眾多復(fù)雜的病原微生物，檢測通量一直是其瓶頸[2]。多重PCR技術(shù)反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與普通PCR相同。由于能在同一反應(yīng)試管內(nèi)同時檢出多種病原體，大大節(jié)省了時間和經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多重PCR方法能在與普通PCR幾乎相同的時間內(nèi)檢測出4種病原體，其檢測的所有的陰性患者中，通過普通培養(yǎng)或PCR法加以對照后顯示，其假陽性率為0'其敏感性和特異性均與普通PCR相同，因此該方法非常適合混合感染（如CAP）的病原學(xué)診斷，因而更具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)相比，敏感性更高，對于難以培養(yǎng)的肺炎衣原體、肺炎支原體，其優(yōu)勢更加明顯[5]。

盡管如此，但多重PCR也具有普通PCR一樣的缺陷，如假陽性、假陰性問題，以及不同的DNA提取方法可能反應(yīng)結(jié)果有所不同[6]。因此臨床醫(yī)師在下結(jié)論是應(yīng)該慎重。另外，多重PCR的費(fèi)用問題也在很大程度上限制了其廣泛應(yīng)用，但考慮到其具有其他方法無可比擬的優(yōu)勢[7，8]，筆者認(rèn)為將其應(yīng)用于臨床并非夢想。

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（收稿日期：2008-12-24）