γ干擾素體外誘導大鼠脾臟樹突狀細胞ＩＤＯ表達的實驗研究

[摘要] 目的 探討γ干擾素（IFN-γ）誘導大鼠脾臟樹突狀細胞（DC）的吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達情況。方法 大鼠脾臟分離培養DC，進行形態特征觀察，流式細胞術檢測DC的表型及確定其純度。分別用不同濃度的IFN-γ誘導作用DC后，熒光定量RT-PCR測定IDO mRNA的相對表達水平。結果 大鼠脾臟分離培養的DC純度可達80%以上，培養10d的DC具有典型的樹枝狀突起，CD80、CD86的陽性表達分別達75%、90%以上。IDO mRNA的表達水平隨IFN-γ的濃度的增大逐漸增加。結論 IFN-γ在體外能誘導大鼠脾臟DC的IDO表達。

[關鍵詞] 樹突狀細胞；吲哚胺-2，3-雙加氧酶；γ干擾素

[中圖分類號] R322.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）12-48-03

Study of γ-interferon-induced Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase of Rat Spleen-derived Dendritic Cells in Vitro

ZHANG Jing1XU Jun2

1.Shanxi Medicine University；2. General Surgery of Shanxi Province People's Hospital，Taiyuan 030012

[Abstract] Objective To study the effect of γ-interferon（IFN-γ） on the indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO） expression in rat spleen-derived dendritic cells（DC）. Methods DC were isolated and cultured from spleen in rat. The morphology of DC observed by microphotograph. The purity and phenotype were analyzed with flow cytometry. Separately with different concentrations of IFN-γ induced DC，relative expression of IDO mRNA were detectec by fluorescence quantitative RT-PCR. Results The purity of cultured DCs above 80%.DCs cultured at 10 days with typical dendritic morphogy. The positive expression of CD80 and CD86 were more than 75% and 90%.Expressions of IDO mRNA with the concentration of IFN-γ increased gradually increase. Conclusion IFN-γ could induce the expression of IDO of rat spleen-derived DC in vitro.

[Key Words] Dendritic cells； Indoleamine 2，3-dioxygenase； γ-interferon

樹突狀細胞（DC）是機體內功能最強的抗原提呈細胞，不僅參與對外來抗原的免疫反應，而且在誘導免疫耐受中也起著重要的作用。DC可通過多種機制誘導免疫耐受。最近有研究表明，DC還可能通過產生吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）來降低T淋巴細胞活性、抑制T淋巴細胞增殖[1-2]，誘導免疫耐受。因此，上調DC細胞的IDO表達可能為誘導移植后免疫耐受的新策略。本研究觀察在γ干擾素（IFN-γ）作用下DC的IDO表達情況，為今后IDO應用于防止移植免疫排斥反應提供一定的實驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI1640培養液、胎牛血清購自美國Hyclone公司，重組大鼠粒細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組大鼠白細胞介素4（rmIL-4）、重組大鼠干擾素γ（IFN-γ）購自美國Pepro Tech公司，脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，PE標記的抗大鼠OX62購自英國AbD serotec公司，PE標記的抗大鼠CD80、FITC標記的抗大鼠CD86購自美國eBioscience公司。反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，IDO與β-actin引物和TaqMan探針由上海基康生物技術有限公司設計。

1.1.2動物來源Wister大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供，8~10周，體重200~250g。

1.2方法

1.2.1脾臟DC的分離與培養頸椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡，無菌取出脾臟，放入盛RPMI 1640 10mL的10cm培養皿中；將脾臟剪碎成1~2mm3的組織塊，碾磨過200目濾膜，將細胞懸液收集于15mL離心管中，1000r/min離心10min，棄上清；細胞沉淀中加入3mL PBS液，用吸管輕輕吹打混勻，加入3倍體積的紅細胞裂解液，冰上放置15min，期間輕輕渦旋混勻兩次，450×g離心10min，棄上清；向細胞沉淀加入2倍細胞壓積的紅細胞裂解液，充分重懸細胞，45×g離心10min，棄上清；PRMI 1640培養液重懸細胞；取15mL離心管，將Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液置于離心管底部，細胞懸液于細胞分離液液面上，比例為2∶1；2500r/min，離心25min；用吸管吸取中間白霧層置于另一干凈離心管，用D-Hank's漂洗液洗滌1次；PRMI 1640完全培養液調整細胞濃度為2×106/mL，接種于12孔培養板，每孔2mL。37℃、5%CO2孵箱培養2h；全量換液，用預熱的PRMI 1640完全培養液沖洗，充分去掉懸浮細胞；加入PRMI 1640完全培養液，添加細胞因子GM-CSF（30ng/mL）、IL-4（40ng/mL）；37℃、5%CO2條件下培養，隔天半量換液一次，添加細胞因子；第8天加入LPS 1μg/mL，繼續培養48h后收集半貼壁細胞。

1.2.2DC的形態學觀察在培養的過程中，每天倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況、形態，集落的數量和大小，以及培養基是否受污染，并拍片。

1.2.3細胞表型分析收集培養10d的DC，PBS緩沖液洗滌2次，調整細胞數為（1~2）×106/mL。每管加細胞懸液200μL，分別加入PE標記的抗大鼠CD80 2.5μL和FITC標記的抗大鼠CD86 1μL，或者PE標記的抗大鼠OX-62 10μL；避光，放置30min，4000r/min，離心5min，棄上清；PBS緩沖液洗滌細胞2次，每管加生理鹽水500μL重懸細胞，流式細胞儀進行細胞表型分析。

1.2.4不同濃度IFN-γ對DC的作用細胞培養第9天分成四組，分別以0、100、300、500U/mL的濃度加入IFN-γ，繼續培養18h后，收集半貼壁細胞用于IDO mRNA的檢測。

1.2.5熒光定量PCR測定IDO mRNATrizol試劑提取不同濃度IFN-γ作用后的DC總RNA，根據Fermentas RT-PCR試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。大鼠IDO擴增片段上游引物為5’-TGAAGATGTGGGCTTTGCTCTA-3’，下游引物為5’-GGCAGATTTCTAGCCACAAGGA-3’，TaqMan探針序列為（FAM）ACATCCACTGGAGGAGCTGCCTGATACG。采用β-actin作為內參，反應體系為25μl，在StepOne TM實時熒光定量PCR儀上進行相對定量PCR反應。擴增條件為94℃ 2min；94℃ 20s，60℃ 40s，循環次數為40次。

1.3統計學處理

采用單因素方差分析（ANOVA）方法，各組測得值以均數±標準差（χ±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2結果

2.1DC的形態學觀察

新分離的DC呈圓形，胞體小；培養第3天胞體圓，無突起；培養第7天出現毛刺狀細胞，毛刺短，細胞呈集落生長（圖1）；培養第10天加LPS刺激后，樹突狀突起明顯，出現典型的DC形態（圖2）。

2.2細胞表型分析

流式細胞儀分析結果顯示，80%以上培養10d的DC表達大鼠DC特異性表達分子OX-62（圖3）；DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達分別為75%和90%以上（圖4）。

2.3IFN-γ作用下DC的IDO mRNA表達

StepOne軟件分析結果示，IFN-γ濃度為0U/mL的DC作為對照，IDO mRNA相對值的均數為1，其他三組的mRNA相對值的均數分別為1.4624、1.4264和2.090。隨著IFN-γ的濃度增大，IDO mRNA的表達水平隨逐漸增加（圖5）。IFN-γ濃度為500U/mL組，IDO mRNA的表達水平明顯高于其他兩組（P＜0.05）。

3 討論

隨著外科技術的日臻完善，器官移植已廣泛開展，但如何控制移植后的免疫排斥反應，誘導宿主對移植物產生免疫耐受，延長移植物的存活時間一直是人們所期待解決的問題。DC是目前發現的最重要的參與免疫耐受的抗原提呈細胞。吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）是細胞內一種亞鐵血紅素的酶，是肝臟以外惟一可催化色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶。

研究發現，IDO至少通過兩種機制引起免疫耐受：①T細胞增殖中的G1期中期對色氨酸非常敏感，IDO過度表達使色氨酸缺乏，T細胞不能有效的增殖和激活[4]；②通過誘導Treg細胞的增殖，產生大量IL-10和TGF-β來抑制T細胞的免疫功能[5]。

IFN-γ主要分布于細胞表面的高親合力的受體IFN-γR（IFN-γ-receptor，IFN GR）來發揮生物學效應的，INF-γ通過與受體結合后使信號轉導轉錄激活因子1（STA T1）與IDO 啟動子的活化序列GAS-2和GAS-3 結合，誘導IDO 的表達。也可通過刺激細胞合成IRF-1，IRF-1 結合于IDO基因上游的ISRE-1 和ISRE-2 從而誘導IDO 的表達[6-8]。本研究從大鼠脾臟提取DC，經紅細胞裂解、淋巴細胞分離及手法篩選，經流式細胞儀鑒定純度高；通過觀察IFN-γ作用下DC的IDO表達情況，結果發現IFN-γ可以明顯上調IDO mRNA的表達，且其表達水平與IFN-γ呈劑量依賴性，IFN-γ500U/mL組的IDO mRNA的表達水平為對照組的2倍，這為IDO運用于誘導抑制免疫耐受提供了實驗基礎。

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（收稿日期：2009-03-02）