ｐＨ值對檸檬酸深層發酵的影響與調節控制探討

陳西偉

摘要 結合檸檬酸深層發酵的生產實際，就檸檬酸深層發酵過程中pH值對微生物生長和代謝的影響做了深入的探討，并對檸檬酸深層發酵過程中pH值變化的原因進行了全面分析，以便在生產中采取相應的檢測和控制措施，使生產菌在發酵過程中處于最適宜的pH值環境下進行，提高檸檬酸發酵生產率。

關鍵詞 檸檬酸；深層發酵；pH值；控制

中圖分類號 TQ920.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0011-02

檸檬酸深層發酵過程中pH值高低直接影響著生產菌（黑曲霉）的代謝活動以及檸檬酸的合成，同時在發酵過程中各種酶促反應也需要在適宜的pH值下進行，因此發酵液的pH值變化是發酵過程中一個重要的控制指標。探討pH值對微生物生長和代謝的影響以及引起發酵過程pH值變化的原因，并采取相應的控制措施，對提高檸檬酸深層發酵產酸率具有重要的指導意義。

1 pH值對菌體生長和代謝產物合成的影響

微生物生長的pH值范圍很廣，大多數pH值在5～9之間，其活動的pH值范圍也存在最高、最適、最低三基點。pH值對微生物的生長繁殖和產物合成的影響有以下幾個方面：一是影響酶的活性，當pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝；二是影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養物質的吸收及代謝產物的排泄；三是影響培養基中某些組分和中間代謝產物的離解，從而影響微生物對這些物質的利用；四是pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發生改變。另外，pH值還會影響某些霉菌的形態。

根據不同微生物生長的最適pH值不同，可將微生物分為嗜酸性、嗜堿性、嗜中性微生物；同種微生物的生長最適pH值和產物積累pH值往往不一致，即使在產物積累階段，由于pH值不同，也可能會得到不同的發酵產物。

2 檸檬酸深層發酵過程pH值的適宜范圍

確定微生物發酵的最適pH值范圍，目的是促使發酵產物的產量最大。最適pH值是根據試驗結果并經生產實踐檢驗確定的。

檸檬酸發酵用的生產菌主要是黑曲霉，為嗜酸性的微生物。黑曲霉的生長以及在發酵過程中的不同階段都需要不同的酸度條件。理論研究和生產實踐證明，黑曲霉可以在很寬的pH值范圍（pH值1.5～11.0）內發育，但在pH值3～7之間比較適宜。黑曲霉發育的適宜pH值與培養基中的氮源有關，在糖合成培養基中，黑曲霉的分生孢子在pH值6.2～7.2之間發芽良好，如果起始pH值＜4.5時就會抑制分生孢子的發育，在pH值＜2.5時分生孢子甚至不能發育，但如果pH值＞7.5時，分生孢子會劇烈膨脹甚至破裂。

對于不同原料的發酵培養基，適宜發酵的初始pH值有較大的區別。試驗證明利用黑曲霉在合成培養基（去離子糖140g/L，NH⁴NO³ 2.5g/L，MgSO⁴ 0.25g/L）中發酵，培養基需要用HCl調節到pH值2.5產酸效果最好。在發酵生產實踐中利用糖蜜原料進行發酵的初始pH值要求在6.8左右。薯干粉培養基由于在發酵前期要利用黑曲霉豐富的酶系使培養基中的淀粉進一步轉化成可利用的葡萄糖，需要把初始pH值控制在糖化酶適宜范圍之內（糖化酶最適宜的pH值在4.0～4.6之間），一般要求其pH值在4.5左右。目前檸檬酸生產多采用玉米糖液（玉米糖化后的過濾液）發酵，其初始pH值可在糖化過程中利用硫酸或者檸檬酸母液調節到4.8～5.2，這樣對糖液的過濾和發酵都很有利。

對于發酵進入產酸期的最適宜pH值，試驗研究和生產實踐相一致。進入產酸氣的pH值在3.0以上容易代謝產生副產物草酸，由于葡萄糖氧化酶最適宜pH值為5.6，在該pH值附近容易形成葡萄糖酸。黑曲霉合成積累檸檬酸是在pH值3.0以下進行的，因此當菌體生長完成后進入產酸期要求pH值降到3.0左右是發酵成敗的關鍵因素，生產中最少要降到3.5才能實現高的產酸率。

發酵液中氮源和磷源種類或數量對發酵最適pH值有很大影響。例如，以NaNO³、（NH⁴）2CO³、尿素為氮源時，即使發酵液在pH值2.6仍然產生很多草酸，最高達11.8g/L。這是因為在NO³ 被利用，碳酸銨和尿素被分解放出氮時，會使細胞內微環境變堿。在磷酸鹽含量少時，蔗糖發酵起始pH值5與pH值2比較，草酸比檸檬酸多；而碳酸鹽含量高時，不論pH值在什么水平，所產生的檸檬酸極少而草酸很多。

總之，發酵微生物生長的最適宜pH值范圍取決于微生物的生態學特性、培養基的成分構成。發酵過程中的不同階段也需要控制相應的最適宜pH值范圍。

3 發酵過程pH值的變化

發酵過程中pH值的變化是微生物代謝反應的綜合結果，與培養基的組成、微生物的代謝途徑有著密切的關系。培養基中堿性物質的消耗和酸性物質的生成自然會引起發酵液pH值的下降，而酸性物質的消耗和堿性物質的生成又可引起pH值的上升。同時其他發酵條件的改變、菌體的自溶以及雜菌污染也將引起發酵液pH值的變化。因此，pH值的變化決定于所用的菌種、培養基的成分和培養條件。

在檸檬酸深層發酵過程中，隨著生產菌種（黑曲霉）對培養基中碳、氮源的利用，以及檸檬酸和其他代謝產物的積累，在正常發酵過程中不同的發酵階段pH值的變化具有一定的規律。一是發酵前期（生長階段）：菌體產生蛋白酶水解培養基中的蛋白質，生成銨離子，使pH值呈上升的趨勢；但隨著菌體量增多，銨離子的消耗也增多，但由于糖被微生物利用合成有機酸使pH值下降而進入產酸期。二是主發酵（產酸階段）：其變化與發酵控制的條件（通風量）和消泡劑的添加量有關。但由于檸檬酸積累量是影響pH值的主要因素，正常發酵中這個階段pH值趨于穩定。三是發酵后期（自溶階段）：隨著養分的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，致使pH值又呈上升趨勢，此時菌體趨于自溶而代謝活動終止。但大量檸檬酸產物的積累總的pH值沒有明顯的變化。

正常發酵過程中，長菌期以后pH值的下降都能達到檸檬酸積累所希望的水平，但pH值的下降速度是值得重視的問題，不能降得太快，否則會導致菌體生長不足和菌體早衰。尤其是在薯干粉直接發酵的情況下，還對糖化酶活力有很大的影響，使糖化不徹底導致發酵殘糖過高，產酸率下降。

引起發酵液pH值下降的因素：①培養基中碳、氮比例不當。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加上溶氧不足，致使有機酸大量積累而pH值下降；②消泡劑加得過多；③生理酸性物質存在，銨被利用，pH值下降。

引起發酵液pH值上升的因素：①培養基中碳、氮比例不當，氮源過多，氨基氮釋放，使pH值上升；②生理堿性物質存在；③添加中和劑；④菌種退化和發酵過程中存在污染雜菌。

4 發酵過程中pH值的檢測

發酵過程中pH值的檢測十分重要，只有通過檢測pH值才能及時發現發酵pH值的變化規律，判斷發酵是否處在相應的最適宜pH值范圍之內，并及時做出相應的調節和控制。實際生產中，通常采用pH試紙和pH電極對pH值進行測量。筆者所接觸的多家檸檬酸生產企業均采用取樣測量發酵pH值，正常發酵每班間斷取1～2次，由于間斷取樣不能及時反映發酵過程的pH值，不利于發酵控制，而且多次取樣會造成發酵液的浪費和環境的污染。目前已試制成功適合于發酵過程適時監測pH值的電極，能連續測定并記錄pH值的變化，將信號放大輸出并顯示或者記錄下來，實現在線檢測。

5 發酵過程中pH值的調節及控制

（1）微生物生長增殖發育的pH值調節與控制。首先考慮和試驗發酵培養基的基礎配方，使它們適當配比，使發酵過程中的pH值在合適范圍內變化。采用淀粉或薯干粉等原料的檸檬酸發酵過程，淀粉的糖化和檸檬酸的合成與積累是處在同一個環境中，都是由檸檬酸產生菌黑曲霉完成的。發酵的技術關鍵是兼顧糖化和產酸，保證糖化速度和產酸速度之間的銜接與平衡。黑曲霉檸檬酸生產菌的酸化糖化酶的最適pH值為4.0～4.6，隨著pH值的下降，尤其當pH值降到2.2時，液化酶和糖化酶會大量被破壞，而檸檬酸發酵的最佳pH值是2.0以下。要解決兩者矛盾，可采用下列方法：一是采用酸化平板馴化，分離在高檸檬酸濃度下糖化酶活力高的菌株；二是通過調節風量來控制，通常在16～18h前控制風量，使pH值維持在有利于菌種生長和糖化作用的范圍。

在薯干粉的檸檬酸發酵中，初始不調節pH值，為自然pH值，約為5.5。當接入菌種后，菌種生長繁殖消耗氮源和銨離子，使培養基的pH值下降，前期（12h）pH值下降較快，活力強的菌種培養12h，pH值可以降至2.3～2.5，這時會有少量的檸檬酸產生，但是由于發酵液固形物較多，原料成分繁雜，其中金屬離子含量較多，緩沖作用大，再加上檸檬酸是3個羧基的有機酸，氫離子釋放是逐步的，所以有時培養48h，才能使pH值降至2.0以下。這樣就有充分的時間讓酸性糖化酶作用，使原料中的淀粉糖化較徹底，進而轉化為大量的檸檬酸。當檸檬酸產量和殘糖含量之和等于或接近起始還原糖時，才能提高通風量，迅速進入產酸期，使pH值迅速降至2.0以下，保證檸檬酸發酵的正常進行。

糖蜜原料本身有酸性的，也有堿性的，在黃血鹽或其他方法處理前要根據不同的情況加以調節。為了得到較高和穩定的發酵產酸率，調酸度時還要考慮加熱時間的影響。對于酸性原料，pH值應調得比堿性原料高些，因為它具有延時緩沖性，它配制的培養基在滅菌后會酸化，稱為返酸，而堿性原料的性質正好相反。pH值調節一般用H2SO⁴或Na2CO³，參與調節范圍為pH值6.0～7.2。

（2）發酵進入產酸期pH值的調節與控制。為了確保發酵的順利進行，必須使其各個階段經常處于最適pH值范圍之內，這就需要在發酵過程中不斷地調節和控制pH值的變化。正常發酵過程中，長菌期以后pH值的下降都能達到檸檬酸積累所希望的水平。如果達不到要求，還可在發酵過程中補加酸或堿。過去是直接加入酸（如H2SO⁴）或堿（如NaOH）來控制，現在常用的是以生理酸性物質（NH⁴）2SO⁴和生理堿性物質氨水來控制，它們不僅可以調節pH值，還可以補充氮源。

經試驗證明，黑曲霉偏好于無機氮，當有機氮和無機氮同時存在時，它首先利用無機氮。在無機氮中，生理酸性氮比堿性氮好，這是因為生理酸性氮中銨離子被利用后，使培養基變酸，可以使發酵中的黑曲霉生長階段結束，轉入產酸階段，pH值下降到較低水平有利于檸檬酸的積累。因此，銨鹽既可以調節代謝，也可以控制pH值。簡單的有機氮比復雜的好，如尿素比氨基酸好，氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培養基上，NH⁴NO³是最好的氮源。黑曲霉以同樣的速度消耗2種氮，所以培養基酸度不變。但糖蜜發酵培養基中還需添加少量NH⁴Cl。若原料中有機氮含量過于豐富，菌生長代謝加快，對縮短發酵周期有利，但是不利于檸檬酸積累，產酸率不高。這就是不能直接利用含蛋白質豐富的粗玉米粉的原因。

另據報道，在檸檬酸發酵中途添加銨鹽，尤其是當發酵中檸檬酸生成速度開始下降時，添加銨離子最為有利，且對菌體無影響，這種效應可能與銨離子對檸檬酸積累調節作用有關。近年來，我國采用高濃度薯干粉發酵，為縮短發酵周期，提高檸檬酸產酸速率，有時也添加0.01%～0.05%的（NH⁴）2SO⁴。

（3）發酵過程通風量對pH值的調節作用。在薯干粉發酵中，黑曲霉還擔負著糖化的任務，糖化的適宜pH值在4.0左右，雖然工業上并不嚴格控制在4.0水平，但在糖化基本完成之前，必須控制低風量使pH值緩慢降到2.5，這個過程需16～18h。當產酸量加上還原糖量接近起始可發酵總量（其差比大于10g/h·L）時，則可以認為糖化已經完成，這時可適當加大風量使發酵進入產酸期。在產酸期內控制風量使產酸速率維持在2～3g/h·L，不得過快，以進一步利用糖化作用和防止菌體過早衰老。

（4）中和劑對發酵pH值調節的應用。為了防止pH值下降過快造成不利影響，也可以在發酵的第18～40h加入少許CaCO³（5～10g/L）以中和酸度，但不得使pH值超過3.0，否則會多產草酸。當用NH⁴+鹽作為氮源時，可在培養基中加入CaCO³，用于中和NH⁴+被吸收后剩余的酸，但在操作中應注意控制染菌危險。

（5）發酵過程pH值的自動控制。檸檬酸深層發酵過程中，生產菌黑曲霉比生長速率和產物檸檬酸合成比生產速率分別有各自的最適宜pH值范圍。因此，應分階段控制生長最適pH值和產物最適pH值?？砂褭z測的pH值結果輸送到pH值控制器以指令加糖、加酸或加堿，實現自動控制，使發酵液的ｐＨ值控制在預定的數值。

6 參考文獻

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