紅豆杉內生菌的分離及抗植物病害活性物質的初步篩選

鄭法新　程　璐　李　俠　房保海　劉　群　劉丹赤　李玉環

摘要 以云南紅豆杉的根、莖、葉為材料，從中分離出內生菌163株，其中細菌91株，真菌48株，放線菌24株；以棉花枯萎、小麥赤霉、番茄葉霉等11種病原真菌作為靶標菌，研究紅豆杉內生菌的抗菌活性，篩選出了有較高抗菌活性的3株內生真菌、11株內生細菌和5株內生放線菌。

關鍵詞 紅豆杉；內生菌；分離；活性物質篩選

中圖分類號 S791.49 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0108-02

植物內生菌（Plant endophyte）是微生物中的一個重要類群，能參與植物次級代謝產物的合成與轉化或獨立合成次級代謝產物，其物種豐富，數量龐大，已經成為新醫（農）藥活性物質的潛在資源。研究顯示，目前從植物內生菌中分離出的生物活性物質，大約51%屬于未報道過的新化合物[1]。因此，植物內生菌相關領域的研究工作愈來愈受到國內外同行的關注。

近年關于傳統藥用植物以及特殊生境中植物的內生菌研究是一個新興的研究熱點[2]。云南紅豆杉（Taxus yunnane-nsis Cheng et L.K.Fu）是含有抗癌藥物紫杉醇的藥用植物，屬紅豆杉科喬木，高達 30m，胸徑可達lm，產于云南西部至西北部、四川西南部、西藏東部，生于海拔2 000~3 500m高山地帶，國外緬甸、錫金、不丹也有分布[3，4]。是否能從與紅豆杉共生的內生菌或其代謝物中尋找其他新型防治植物病蟲害藥物，筆者從紅豆杉中分離的細菌及真菌，以棉花枯萎、番茄葉霉等植物病害微生物為篩選模型來篩選紅豆杉內生菌產生的抗病活性物質進行嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。于2008年9月選擇云南省維西縣塔城鄉天然長成的成熟健康紅豆杉植株，采集沒有腐爛發霉及病斑、病蟲害的健康新鮮植物組織備用。

1.1.2 病原菌。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp.Vasinfe-ctum），西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.niveum Snyder et He-ansen），蘋果爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada），玉米彎孢病菌（Curvularia lunata），蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata），小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis），番茄早疫病菌（Alternaria so-lani），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum Schw），葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata Spauld），馬鈴薯干腐病菌（Pythium sola-ni），番茄葉霉病菌（Fulria fulva），以上菌株由山東出入境檢驗檢疫局房保海工程師饋贈。

1.1.3 培養基。分離細菌所用培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，即瓊脂20g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1 000mL，pH值7.0～7.2。分離真菌以及靶標菌的培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基，即馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000 mL。分離放線菌培養基為高氏Ⅰ號培養基，即可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 0.5g，瓊脂20g，水1 000mL，pH值7.2～7.4。培養基在高壓滅菌后備用，純化培養基與分離培養基組成成分相同。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離。先用自來水將所采集的紅豆杉植物組織表面沖洗干凈，晾干水分后分別切取根、莖和葉，采用下述方法進行表面消毒[5]：0.1%升汞漂洗（10～30s）→無菌水沖洗數次→75%酒精漂洗（30～60s）→無菌水沖洗數次。在無菌操作條件下取根、莖和葉，切成0.2cm×0.2cm長段（片），種植于加青霉素的PDA培養基中，在（28±1）℃條件下置于溫箱靜止培養3～7d。同時將上述經表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養基中，在（28±1）℃條件下置于溫箱培養，檢查表面消毒是否徹底。

1.2.2 內生放線菌和細菌的分離。將無菌處理的紅豆杉根、莖、葉樣品各3g，每樣品加10mL 無菌水碾碎靜置15min后，用無菌移液槍各取70μL涂在牛肉蛋白胨培養基、高氏Ⅰ號培養基平板上，28℃黑暗培養，分離細菌培養3～5d，分離放線菌培養5～8d。

1.2.3 內生菌的純化。對內生真菌，取切口處新長出的菌絲，及時轉接至新鮮PDA培養基上，對內生細菌和內生放線菌，待菌落出現后，根據菌落形態、顏色的差異以及長出時間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的細胞接于新的牛肉膏蛋白胨培養基和高氏Ⅰ號培養基上進行劃線分離培養。培養數日后，觀察菌落的形態及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應的記錄。對菌株編號后，轉至新鮮箱斜面培養基上，于28℃培養箱中培養5～7d，然后放入4℃冰箱保存[6]。

1.2.4 拮抗菌活性測定。拮抗菌活性測定采用對峙培養法。在超凈工作臺上進行無菌操作：將直徑6mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養基的培養皿中央，再用直徑6mm的打孔器在生長7d左右的內生真菌菌落邊緣制備菌餅，并接種于PDA平板上距中心2cm處同一直線的兩點上，對照不接篩選菌，28℃下培養72h，測量各篩選菌菌落邊緣和病原菌菌落邊緣之間的抑菌距離，選擇拮抗作用明顯的菌進行復篩或鑒定[7-9]。該試驗重復2次，每次設3個重復。細菌和放線菌的抗病原真菌活性篩選采用混澆平板法。用PDA液體培養基28℃下振蕩培養12h，發酵液10 000 rpm離心10min，取上清液，重復3次。將1.5mL濾液和15 mL PDA培養基于60℃左右混合均勻倒入培養皿，冷卻凝固后，在每個培養皿中接入直徑為6mm的供試病原真菌菌塊，28℃下培養4d。以直接培養的病原菌作為對照[10，11]，發酵液活性高的菌株將會抑制病原菌的生長。

2 結果與分析

2.1 紅豆杉不同組織部位內生菌數量

對分離自紅豆杉不同組織部位的內生菌數量進行分析，結果表明，紅豆杉不同組織部位的內生菌種類和數量存有較大的差異，總體上來說，內生菌數量在紅豆杉根中的分布最多，葉子中的內生菌數量最少；同時，無論是在根還是在莖和葉中大致的規律是內生細菌數量最多，其次是真菌，放線菌數量最少，也就是細菌、真菌和放線菌依次呈遞減的趨勢（見表1）。

2.2 內生真菌對病原真菌的拮抗作用

從紅豆杉的各種組織中分離得到內生真菌48個菌株，通過對峙生長法，測定了內生真菌各菌株對其中11種病原真菌的皿內拮抗作用，結果表明，其中5株內生真菌對7 種病原真菌有較強的拮抗作用（見表2）。

由表2可以看出，分離得到的內生真菌都有不同程度的抑菌作用，其中根和莖中分離的TFR3、TFR5、TFR14、TFS1、TFS14的抑菌作用最強，最為顯著的是TFR5對蘋果炭疽的拮抗作用。

2.3 內生細菌、放線菌對病原真菌的拮抗作用

經過混澆平板法培養4d，觀察并記錄結果，發現4株放線菌、8株細菌的發酵液都有很高的抑菌活性（見表3、表4）。

有抑菌作用的細菌占分離得到的內生細菌總數的13.75%，真菌占20.83%，放線菌占37.5%。其中TAR1對小麥紋枯病菌、蘋果爛病菌、馬鈴薯干腐，TAR11對小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋果爛病菌，TAR13對小麥紋枯病菌、蘋果爛病菌，TAS1對馬鈴薯干腐、葡萄炭疽、番茄早疫，TAS2對番茄葉霉病菌、西瓜枯萎病菌、蘋果爛病菌、葡萄炭疽、番茄早疫，TAS5對番茄早疫，TAS6對西瓜枯萎病菌、小麥赤霉，TBR1對玉米彎孢、馬鈴薯干腐，TBR5對小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋果爛病菌，TBR13對番茄葉霉病菌、蘋果爛病菌、玉米彎孢、馬鈴薯干腐、番茄早疫，TBR14對番茄葉霉病菌、西瓜枯萎病菌、蘋果爛病菌，TBR17對小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋果爛病菌，TBR21對西瓜枯萎病菌、小麥赤霉，TBR25對西瓜枯萎病菌，TBR27對玉米彎孢、馬鈴薯干腐、葡萄炭疽、番茄早疫，TBR36對番茄葉霉病菌，TBS3對西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌都有很強的抑制作用，基本限制了病原體菌絲的生長與繁殖。

3 結論與討論

試驗結果表明，云南紅豆杉組織內存在豐富的內生菌，不同組織內生菌的數量、種類有一定差異，在具有抑菌活性的菌物中，放線菌占的比例最高。另外，由于細菌也能產生豐富的次級代謝產物，因此可作為對多種病原菌具有抑菌活性物質篩選的資源。

目前，植物內生菌分離方法大多數采用常規表面消毒法，本試驗對此方法進行了改進，先用消毒效果更好的0.1%升汞漂洗10～30s進行消毒。為確保所分離到的微生物為植物體內生菌，采用的表面消毒比一般組織培養消毒更為嚴格，并對所消毒材料沖洗后的第4次無菌水進行涂板培養，如在2～3d內沒有菌落產生，則認為該材料消毒徹底，證明所分離到的為內生菌。但用此消毒方法也易于殺死植物體內微生物，因而所分離到的內生菌種類與數量可能比植物體內所含的要少些。

在進行內生菌分離的過程中，掌握適宜的材料消毒時間對最終分離到的內生菌的數量和種類都具有極其重要的作用。另外，所用培養基均為常規分離用的培養基，因而不能保證所有生活在紅豆杉組織內的微生物能夠全被分離出來，可能有的稀有微生物不能在人工培養基上生長。所選用的材料為天然生長70年左右的紅豆杉樹，所以不能確定生長期更長的紅豆杉材料中內生菌數量和種類是否更多，產出的活性物質是否更強，這有待進一步探索和研究。試驗選用的測試菌種也是從本實驗室隨機選取的，不能測出內生菌對所有病原菌的抑制作用，只是做了初篩，為進一步復篩奠定了基礎。內生菌系統地分布于植物體根、莖、葉、花、果實和種子等器官、組織的細胞或細胞間隙。近年來，已從宿主植物的根、莖、葉及儲藏器官內分離到大量內生細菌。本試驗從根、莖中分離出細菌和真菌數量較多，從葉中分離出少量內生真菌，與文獻報道的葉片內生真菌分布比較少的結論類似；從根中分離出較多量內生真菌的結果與文獻報道的不同。

4 參考文獻

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