論狂犬病疫苗的研究進展

王根龍　成建忠

摘要 概述了狂犬病疫苗的研究進展，以期為合理應用疫苗及了解其發展趨勢提供參考。

關鍵詞 狂犬病；傳統疫苗；細胞疫苗；新型疫苗；研究進展

中圖分類號 R512.9903 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0223-02

1 傳統疫苗

1885年巴斯德嘗試用感染狂犬病毒固定毒的兔脊髓并于室溫干燥，經此制備的疫苗試驗后在1885年首次應用于人并獲得了成功。1908年Fermi通過在室溫下用1%酚處理組織改進了巴斯德的方法。1911年Semple 應用羊腦組織的勻漿物制備疫苗，提高了疫苗的易感性。應用化學方法如酚、β－丙內脂制備了無毒性的Semple 疫苗。我國自1949年起，一直使用由山羊腦組織制備的Semple 疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠腎細胞和BHK細胞疫苗取代。腦組織疫苗由于注射量大（每針2mL），接種次數多（14針以上），接種后易引起神經變態反應，抗體產生慢而且水平低等原因，WHO狂犬病專家委員會在第七次報告（1984年）中支持限制和放棄生產腦組織疫苗，并極力提倡使用滅活的細胞培養疫苗。

2 細胞疫苗

2.1 人二倍體細胞疫苗（HDCV）

1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并進一步通過比較試驗最終將來源于Semple疫苗生產用PM狂犬病毒株適應到W1～38人二倍體細胞株（后來又適應到MRC 5細胞）。該疫苗于1974年首次獲準生產，并于1978年開始商品化。HDCV不含任何神經毒因子，并不含任何外源動物雜質，因而可以解釋它在重復注射后較好的耐受。采用NIH法檢測疫苗的穩定性證實，疫苗在4℃和37℃放置1個月后，無明顯差異。進一步將5批效價為4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年，所有批號滴度均大于2.5IU/劑。早期調查發現，HDCV預防接種后1個月或3個月達到抗體峰值（10IU左右），隨后便逐漸降低，但1～2年內滴度始終大于0.5IU，通過1～3年內加強免疫后，抗體滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途徑相近。

人二倍體細胞（HDC）為正常核型細胞，無致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美國、加拿大、大多數歐洲國家和幾個亞洲國家使用，這使其成為評價任何一種人用新疫苗的標準疫苗[1]。HDCV的缺點在于HDC不太容易培養，而且狂犬病毒在HDC上培養的病毒滴度相對較低，僅能在空間有限的細胞瓶內培養，這使得疫苗的價格非常昂貴。在美國，用HDCV暴露后處理一個療程費用高達1 000多美元；而在巴基斯坦，用羊腦組織苗（SemPle疫苗）進行全療程處理只需2.5美元，這樣就限制了該疫苗在發展中國家的使用。

2.2 原代細胞培養疫苗

用地鼠腎細胞組織培養狂犬病毒發展滅活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje進一步發展，將SAD狂犬病毒固定毒適應到地鼠腎細胞（PHKC）上生產滅活的疫苗，并獲得成功。1968年該疫苗在加拿大批準用于人體加強和暴露前接種。

我國的PHKCV由衛生部武漢生物制品研究所林放濤領導的小組研制而成。試驗開始所用毒種為北京株兔腦固定毒，經“混合細胞培養法”在PHKC上適應，連續傳50～60代適應成功；再經豚鼠腦和PHKC交替3次傳代的毒株稱為aG株。aG株病毒在PHKC上培養收獲，福爾馬林滅活，加Al（OH）3佐劑。疫苗規定效價為1.3～2.5IU，經超濾濃縮后，濃縮疫苗效價需＞2.5IU。經臨床試驗證明，各種劑型的PHKCV在人體中的抗體反應均優于羊腦Semple疫苗。目前，原代地鼠腎細胞狂犬病疫苗（PHKC－RV）在我國、原蘇聯及部分東歐國家使用。我國的PHKC－RV使用量大，占全世界所有各種細胞疫苗總使用量約80%，其有效性已被大量實驗室與臨床觀察結果充分證實，并受到國外學者的首肯。我國的PHKC－RV有佐劑疫苗、佐劑濃縮疫苗與凍干濃縮疫苗3種，均已納入國家規程。為盡量減少可能出現的副作用，少量生產的濃縮疫苗宜進行精制。

Van Wezal等1978年使用狂犬病毒PM株適應到狗腎細胞，并使用了微載體以使疫苗大規模生產。疫苗對暴露前后的人體接種試驗在荷蘭進行，獲得的免疫反應和HKCV具可比性，并于1980年獲準在荷蘭生產。狂犬病毒PU11株在牛腎原代細胞上培養31代作為毒種，用胎牛腎原代細胞培養收獲病毒，經滅活、濃縮、純化后制作的牛腎細胞疫苗，抗體效價達5～25IU，采用6針法免疫，該疫苗已在法國批準用于暴露前和暴露后預防接種[2]。1983年Barth等從日本疫苗分化出一種用Flary LEP株適應到雞胚細胞上的純化雞胚細胞疫苗（PCECV）。培養病毒采用β－丙內酯滅活，并經蔗糖梯度區帶離心純化和濃縮。該疫苗目前由德國Chiro Behring GmbH公司生產。人體暴露前后的臨床試驗結果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相當，并且不會誘生針對雞細胞蛋白的抗體，使用該疫苗僅產生輕微的局部反應。

2.3 傳代細胞系疫苗

2.3.1 非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）疫苗。1984年由法國Merieun研究所研制成功。制備過程中采用了使細胞貼附在微載體上懸浮培養的微載體技術以便進行工業化大罐培養。該疫苗使用的病毒株與HDCV相同，為PM1503-3M。收獲的病毒經超濾濃縮、密度梯度離心β-丙內酯滅活制成凍干疫苗。早期研究證實，在100個接種的試驗動物體內沒有病毒轉移，每劑疫苗的殘余細胞DNA量小于50pg，疫苗的穩定性極好，與HDCV相似。大量試驗證實無論用作暴露前人體免疫或暴露后處理，Vero疫苗均獲得了很好的免疫效果。由于Vero細胞較HDC能生產較高的狂犬病毒滴度，并可利用微載體技術進行工業化大罐培養，因而其價格較HDCV便宜。但是用Vero細胞制備疫苗需在低細胞代數使用以確保無致瘤性，且殘余細胞DNA量需小于100pg/劑。我國從1995年開始進行色譜純化的人用Vero細胞疫苗的研制。制備過程中使用的病毒株是適應到Vero細胞的狂犬病毒CTN-1。目前已有包括衛生部上海生物制品研究所在內的多家生物制品研究所研制成功，并獲得生產文號，以逐步取代我國現行的地鼠腎細胞疫苗。

2.3.2 幼倉鼠腎細胞（BHK細胞）疫苗。早在20世紀70年代就有利用懸浮生長的BHK細胞感染Flary LEP株病毒生產滅活的獸用狂犬疫苗的報道。進入90年代后，法國巴斯德研究所將生物反應器應用到BHK細胞懸浮培養，制備1種試驗狂犬病疫苗。制備時使用了1種PV Paris/BHK21狂犬病毒適應株，并采用了1種新的無血清培養基，這種試驗疫苗在小鼠體內獲得了滿意的保護活力。他們進一步使用這種簡單的BHK狂犬病疫苗在人類志愿者中進行了初步試驗，證實該疫苗有好的免疫原性和耐受性。注射給地鼠后完整的BHK細胞是致瘤的，但當以病毒滅活的濃度用β－丙內酯處理細胞后，這種腫瘤原性便被除掉。另外，通過現有的純化技術，殘余的細胞DNA可降到最低量。BHK細胞是狂犬病毒的高產細胞，并可在生物反應器中大規模培養，這一途徑有助于那些希望開始制備細胞疫苗的發展中國家生產獸用和人用狂犬病疫苗。

3 新型疫苗

利用基因重組技術，狂犬病毒中起主要免疫作用的糖蛋白及核蛋白已在不同的載體系統中得到表達。這些載體包括痘病毒、腺病毒、桿狀病毒、質粒DNA等。有望最終發展成為安全有效的人用基因工程疫苗。

4 參考文獻

[1] COX JH，B DIETZSCHOLD，L G SCHNEIDER.Rabies virus glyc-oprotein II.Biological and serological characterization[J].Infect Immun，1997（16）：751.

[2] LAO TR，MINAMOTO N，ITO H，et al.A virus～neutralizing epitope on the glycopmtein of rabies virus that contains Trp251 is a linear epitope[J].Virus Res，1997，51（1）：35.