高效液相色譜法測定谷物及其制品中赭曲霉毒素A

劉玉芳 莊新華 李學云 劉 冰 許美玲

摘要針對谷物及其制品可能污染的霉菌毒素——赭曲霉毒素A,用免疫親和柱凈化高效液相色譜法進行了驗證。

關鍵詞赭曲霉毒素A;高效液相色譜法;谷物及其制品;OchraTest免疫親和柱

中圖分類號O657.7+2;TS207.7文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)14-0322-01

赭曲霉毒素A是曲霉屬和青霉屬一些菌種的有毒產物,動物毒性試驗表明,赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神經毒性、致畸性及致癌性。1993年,國際癌癥研究中心已將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。被赭曲霉毒素A污染的谷物及其制品是人體內赭曲霉毒素A的主要來源,通過對谷物及其制品中赭曲霉毒素A的檢測可以估計人體每天攝入量。目前國際上檢測赭曲霉毒素A的方法有薄層層析法、酶聯免疫吸附法及高效液相色譜法等,高效液相色譜法是最常用的方法。本文驗證了用高效液相色譜法測定谷物及其制品中赭曲霉毒素A含量的方法,現報告如下。

1材料與方法

1.1試驗原理

將試樣與提取溶液混合后高速均質、過濾得到提取液,提取液經稀釋后加入到裝有赭曲霉毒素A專一化抗體的免疫親和柱中,使樣品中的赭曲霉毒素A與抗體結合。淋洗除雜質后,以甲醇洗脫溶液使赭曲霉毒素A與抗體分離洗脫,供液相色譜定性定量測定。

1.2材料與設備

1.2.1材料。色譜純已腈、純水、乙酸、磷酸鹽緩沖液、色譜純甲醇、折疊濾紙、微孔玻璃纖維濾紙、赭曲霉毒素A標準品。

1.2.2設備。OchraTest免疫親和柱,Agilent1100液相色譜儀(帶有熒光檢測器),高速均質機,手動玻璃注射器泵流架,電子天平(感量1g),谷物粉碎機。

1.3樣品測定方法

1.3.1提取。稱取50g磨細的樣品,置于攪拌杯中,加入100 mL乙腈水溶液(乙腈∶水=60∶40),蓋上攪拌杯的蓋子,高速攪拌1min,取下蓋子,將提取物倒入槽紋濾紙上,濾液收集于干凈的容器中。

1.3.2提取物的稀釋。移取10mL上步的濾液,置于干凈的容器中,用40mL純水將濾液稀釋、混勻,將上步稀釋液通過玻璃微纖維濾紙過濾器,濾液收集于玻璃注射器筒中。

1.3.3分離柱色譜操作。將上步10mL濾液以1~2滴/s的流速全部通過OchraTest免疫親和柱,直至空氣進入到親和柱中。將10mL磷酸鹽緩沖液以1~2滴/s的流速全部通過親和柱,直至空氣進入到親和柱中。將10mL純水以1~2滴/s的流速全部通過親和柱,直至空氣進入到親和柱中。用1.5mL色譜純甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱,收集全部淋洗液與2mL小瓶中,供測試用。

1.3.4測定。液相色譜條件:色譜柱流速:1mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:激發波長333nm,發射波長477nm;流動相為水∶乙腈∶乙酸=99∶99∶1;進樣量:30μL。

1.3.5液相色譜測定。赭曲霉毒素A不同濃度標準溶液的液相色譜出峰面積線性關系見表1,赭曲霉毒素A標準品的液相色譜圖見圖1。

1.3.6計算方法。樣品中赭曲霉毒素A(μg/kg)=C×V/m,其中,C為液相色譜儀測得的樣品溶液的濃度,μg/L;V為樣品溶液的定容體積,mL;m為樣品質量,g。

2結果與分析

2.1流動相的選擇

在其他色譜條件不變的情況下,分別用甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)、乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)2種溶液作流動相,赭曲霉毒素A標準溶液濃度5ug/L,進樣30μL。試驗表明,甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流動相在30min內無色譜峰出現,乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流動相在6.7min出峰,且被測組分有較高的靈敏度,所以選用了后一種溶液作流動相。

2.2回收率與精密度

2.2.1回收率試驗。在面粉樣品中分別加入濃度為0.8μg/L、4.0 μg/L的赭曲霉毒素A標準溶液,回收率分別是82.0%、96.3%。

2.2.2精密度試驗。取分別加入5μg/L、10μg/L赭曲霉毒素A標準溶液的3個樣品,每份樣品3個平行樣,在相同條件下連續每份樣品6次重復測定,每份樣品測定18次,分別計算各種濃度測定結果的相對標準偏差(RSD),其結果為9.21%和7.58%。

3結論

免疫親和柱凈化高效液相色譜法測定谷物中赭曲霉毒素A不僅測定靈敏度高,準確可靠,而且快速、經濟、實用。