地錦組織培養(yǎng)及無(wú)性系建立研究

劉 洋 馬 靜 葛 寧 徐 娜 姜長(zhǎng)陽(yáng)

摘要以生長(zhǎng)旺盛的地錦嫩莖為材料,進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)和分化、不定芽的分化及試管苗的生根、移栽、扦插和移植的研究,結(jié)果證明:MS+BA 0.4~0.6mg/L+2,4-D 1.5~2.0mg/L是誘導(dǎo)嫩莖形成具有分化能力愈傷組織的理想培養(yǎng)基;MS+AgNO3 0.8mg/L+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1mg/L是誘導(dǎo)愈傷組織分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基;B5+BA 0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L是不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基;B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L是試管苗生根繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基;移植的試管苗具有生長(zhǎng)旺盛整齊、根系發(fā)達(dá)、開(kāi)花結(jié)果時(shí)間推遲15d左右的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞地錦;愈傷組織;不定芽;培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào) S567.21+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)21-0077-02

地錦(Euphorbia humifusa)又稱(chēng)地錦草、鋪地錦、地錦大薊,屬于大薊科大薊屬一年生草本植物,生長(zhǎng)于荒地、路旁或田間[1,2]。除了廣東、廣西外,全國(guó)各地均有分布。地錦全草均可入藥,具有清熱解毒、涼血止血、利濕、消腫、退黃等功效,能治急性痢疾、肝毒赤白、肝炎、黃疸、咳血、尿血、便血、外傷出血、跌打損傷、熱毒瘡疼等疾病;外用能治跌打腫疼、皮膚濕疹、下肢潰瘍、毒蛇咬傷等[3,4]。由于地錦具有多種藥用價(jià)值,近年來(lái)人們進(jìn)行廣泛地采收,導(dǎo)致這種野生植物資源迅速減少。雖然現(xiàn)在已有大戟科藥用植物組織培養(yǎng)研究的報(bào)道[5,6],但迄今未見(jiàn)地錦組織培養(yǎng)、無(wú)性系建立研究的報(bào)道。為保護(hù)地錦,滿足人們需要,筆者對(duì)其進(jìn)行了組織培養(yǎng)及無(wú)性系建立的研究。

1材料與方法

1.1材料及滅菌

6月中旬,把大連郊區(qū)農(nóng)田中生長(zhǎng)非常旺盛的地錦采回來(lái)后,將嫩莖剪下,放到250mL的磨口廣口瓶中,流水沖洗15min左右,用0.05%安利洗滌液振蕩洗滌約10min,再用蒸餾水洗至無(wú)泡沫時(shí)移至超凈工作臺(tái)上;倒入70%~75%乙醇滅菌約10s,迅速用無(wú)菌水洗滌1次,再用0.05% HgCl2溶液振蕩滅菌16min,接著用無(wú)菌水振蕩洗滌5次。再將無(wú)菌嫩莖切成長(zhǎng)約0.3cm的莖段,接種到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上,進(jìn)行培養(yǎng)觀察。

1.2培養(yǎng)條件

以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。以MS為基本培養(yǎng)基時(shí),加蔗糖30g/L;以1/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí),加蔗糖15g/L;培養(yǎng)基胨力強(qiáng)度為180g/cm2[7],pH值5.8~6.0,培養(yǎng)溫度20~28℃,光照12h/d,光照度2 500Lx左右。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1愈傷組織的誘導(dǎo)。將無(wú)菌莖段接種到以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的BA、IBA、2,4-D和IAA的培養(yǎng)基上,進(jìn)行嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。每處理接種100個(gè)莖段,重復(fù)4次。接種培養(yǎng)60d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.2愈傷組織的分化。把上述繼代培養(yǎng)的愈傷組織分散成獨(dú)立的顆粒狀后,接種到以MS+ AgNO3 0.8mg/L為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的BA、IBA、NAA的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)。每處理接種100個(gè)愈傷組織顆粒,重復(fù)4次。培養(yǎng)50d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.3不定芽的分化。把上述分化培養(yǎng)的不定芽從基部切下,分別接種到以MS+BA 0.5mg/L、1/2 MS+BA 0.5mg/L、1/3 MS+BA 0.5mg/L、B5+BA 0.5mg/L、White+BA 0.5mg/L、LS+BA 0.5mg/L為基本培養(yǎng)基,分別附加濃度為0.1mg/L的IBA、NAA和IAA的共18種培養(yǎng)基中,進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)和分化繼代培養(yǎng)。重復(fù)4次,每次重復(fù)繼代培養(yǎng)5代,每處理接種100個(gè)材料。培養(yǎng)45d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.4試管苗的生根培養(yǎng)。把上述分化培養(yǎng)的高0.7cm以上的不定芽從基部剪下,把下部切口在濃度為20mg/L的NAA溶液中處理5min后,接種到1/2 MS+IAA 0.1mg/L、1/3 MS+IAA 0.1mg/L、B5+IAA 0.1mg/L、White+IAA 0.1mg/L、LS+IAA 0.1mg/L等6種培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。每處理接種200個(gè)材料,重復(fù)4次。培養(yǎng)30d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.5試管苗的生根繼代培養(yǎng)。把上述由不定芽培養(yǎng)的生根試管苗剪成長(zhǎng)1cm左右、至少具有2個(gè)葉片的莖段,接種到MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、1/2 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、1/3 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、White+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1 mg/L、LS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L等6種培養(yǎng)基上進(jìn)行生根繼代培養(yǎng)試驗(yàn)。每處理接種100個(gè)材料。重復(fù)4次,每次重復(fù)試驗(yàn)繼代培養(yǎng)5代,培養(yǎng)25d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.6試管苗的移栽和扦插。打開(kāi)繼代培養(yǎng)瓶瓶塞,置于4 500Lx左右的光照下煉苗,4d后把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出,剪下上半段,洗凈基部的培養(yǎng)基后,把具有根的試管苗移栽到表層約為7cm厚的爐灰渣、下層為肥沃苗床土的溫室苗床上,然后彌霧澆透水,保持濕度95%左右、溫度20~28℃、無(wú)直射光照的條件。每處理移栽200個(gè)材料。重復(fù)4次,移栽后30d統(tǒng)計(jì)觀察。把移栽試管苗剪下的上半段的下部剪口放到70mg/L的NAA溶液中處理4min后,扦插到已經(jīng)澆透水并打上深約1cm 小孔的與移栽條件相同的溫室苗床的爐灰渣上,隨后彌霧噴澆清水淤閉插孔,再按照與移栽試管苗相同的條件進(jìn)行管理。每處理扦插200個(gè)材料,重復(fù)4次,扦插后30d觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.7試管苗的移植。把移栽和扦插成活的試管苗連續(xù)3年于6月上旬分2次移植到農(nóng)田中栽培,每次移植400株。移植后每隔20d觀察統(tǒng)計(jì)1次。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度的激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可知,只有在不同濃度生長(zhǎng)素、2,4-D的培養(yǎng)基上才能誘導(dǎo)莖段形成愈傷組織;其中在濃度分別為0.4 mg/L、0.6mg/L和0.8mg/L的BA與濃度為1.5mg/L、2.0 mg/L和2.5mg/L的2,4-D配合使用時(shí),莖段能100%誘導(dǎo)形成愈傷組織,但誘導(dǎo)的外部形態(tài)卻差異較大。其中濃度0.4 mg/L、0.6mg/L的BA與濃度為1.5mg/L、2.0mg/L的2,4-D配合使用時(shí),不僅愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到了100%,而且愈傷組織的生長(zhǎng)速度快,外觀呈嫩綠色的顆粒狀,顆粒之間連接較為疏松,容易分開(kāi)。一般認(rèn)為,這種愈傷組織為具有分化能力的愈傷組織[8]。把上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織分散為獨(dú)立的顆粒后,在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng),每次重復(fù)試驗(yàn)連續(xù)繼代培養(yǎng)7代的結(jié)果表明,不僅所形成的愈傷組織仍為綠色顆粒狀的愈傷組織,而且愈傷組織繼代培養(yǎng)的周期為50d,每個(gè)繼代周期繁殖系數(shù)為24.5。這說(shuō)明,MS+BA 0.4~0.6mg/L+2,4-D 1.5~2.0mg/L的培養(yǎng)基是誘導(dǎo)地錦嫩莖形成具有分化能力愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.2不同濃度的激素對(duì)愈傷組織分化的影響

觀察表明,培養(yǎng)15d左右,在有的培養(yǎng)基上可見(jiàn)分化出不定芽。由表2可知,50d觀察統(tǒng)計(jì)時(shí),在不含任何激素、BA、IBA、NAA單獨(dú)使用和BA與濃度分別為0.1mg/L、0.3mg/L的IBA配合使用的培養(yǎng)基上愈傷組織不能分化。而在0.3 mg/L、0.6mg/L的BA與濃度分別為0.1mg/L、0.3mg/L的NAA配合使用的培養(yǎng)基上,愈傷組織均能分化。但從愈傷組織的分化率、每個(gè)培養(yǎng)顆粒分化不定芽數(shù)和分化不定芽的長(zhǎng)勢(shì)看,在BA濃度為0.6mg/L、NAA的濃度為0.1mg/L的培養(yǎng)基上,不僅顆粒狀愈傷組織分化率達(dá)到了95%、平均每個(gè)愈傷組織分化的不定芽數(shù)為7.1個(gè),而且分化的不定芽長(zhǎng)勢(shì)好。4次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。由此可知,MS+ AgNO3 0.8mg/L+BA 0.6mg/L+ NAA 0.1mg/L是誘導(dǎo)地錦愈傷組織分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.3不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化的影響

觀察統(tǒng)計(jì)表明,B5+BA 0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L培養(yǎng)的材料,不僅平均分化率為95%,每個(gè)培養(yǎng)不定芽經(jīng)過(guò)45d的培養(yǎng),可分化形成6.4個(gè)、高0.7cm以上、莖粗0.13~0.20cm的不定芽,而且不定芽生長(zhǎng)旺盛。不定芽繼代分化培養(yǎng)的結(jié)果與上述基本一致。由此可知,B5+BA 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/L是地錦不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.4試管苗的生根培養(yǎng)

觀察統(tǒng)計(jì)表明,在B5+IAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d時(shí),大部分培養(yǎng)的材料會(huì)生長(zhǎng)出可見(jiàn)根,隨后,伴隨著根數(shù)的增加、根的生長(zhǎng),試管苗生長(zhǎng)速度加快。培養(yǎng)到30d時(shí),97%的培養(yǎng)材料會(huì)培養(yǎng)生長(zhǎng)為具有5~11條根、12~23條氣生根、高3.2~4.7cm、9~15片葉片、莖粗0.2cm左右、生長(zhǎng)旺盛的試管苗。由此可知,把下部切口在濃度為20mg/L的NAA溶液中處理5min后,在B5+IAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽生根培養(yǎng)的方法,是地錦不定芽生根培養(yǎng)的理想培養(yǎng)方法。

2.5試管苗的生根繼代培養(yǎng)

觀察表明,在B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)到7d時(shí),大部分培養(yǎng)的材料會(huì)生長(zhǎng)出1~2條可見(jiàn)根,隨后,可見(jiàn)根數(shù)迅速增加,試管苗快速生長(zhǎng)。培養(yǎng)到25d時(shí),99%的培養(yǎng)材料會(huì)培養(yǎng)生長(zhǎng)為具有7~16條根、約20條氣生根、高4.4cm左右、約14片葉片、莖粗0.22cm、生長(zhǎng)非常旺盛的試管苗。每個(gè)繼代培養(yǎng)周期的繁殖系數(shù)為4.1。4次重復(fù)試驗(yàn)(繼代培養(yǎng)5代)結(jié)果基本一致。由此可知,B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L是地錦試管苗生根繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.6試管苗的移栽和扦插

試管苗移栽后12d可見(jiàn)成活,并長(zhǎng)出新葉;30d統(tǒng)計(jì)其成活率為99%,生長(zhǎng)較旺盛。試管苗扦插后14d成活,并正常生長(zhǎng);30d統(tǒng)計(jì)其成活率為92%。扦插的試管苗前期生長(zhǎng)較慢、植株較小,50d開(kāi)始旺盛生長(zhǎng),60d外觀長(zhǎng)勢(shì)與移栽苗基本一致。

2.7試管苗的移植

移植的成活率為99.5%。3年觀察表明,移植的試管苗初期植株較小,生長(zhǎng)速度較慢。移植60d后開(kāi)始迅速生長(zhǎng)。與野生植株相比,移植的試管苗出現(xiàn)了生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)整齊、根系增加1倍左右、開(kāi)花結(jié)果時(shí)間推遲15d左右的特點(diǎn),其他植物學(xué)性狀保持不變。

3結(jié)論與討論

以地錦的嫩莖為材料,成功地誘導(dǎo)形成愈傷組織,建立起生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)整齊、根系發(fā)達(dá)的嫩莖無(wú)性系,不僅證明地錦的非分生組織也具有全能性,而且還為該植物的人工保護(hù)和栽培奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。以愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖,50d的繁殖系數(shù)為24.5。按照這個(gè)速度,每年能繁殖出24.57.3個(gè)后代;用不定芽分化培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖,45d的繁殖系數(shù)為6.4,按照這個(gè)速度,每年能繁殖出6.48個(gè)后代;用生根培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖,25d的繁殖系數(shù)為4.1,按照這個(gè)速度,每年能繁殖出4.114.6個(gè)后代。由此可知,不論采用哪種方法進(jìn)行繁殖,每年都能繁殖出大量的試管苗,滿足人們的需要,但從試管苗移栽的角度看,應(yīng)采用生根繼代的方法進(jìn)行繁殖。這是因?yàn)橛蒙^代的方法進(jìn)行繁殖,不僅試管苗生長(zhǎng)非常旺盛、沒(méi)有無(wú)效苗,而且容易移栽成活。因此,生產(chǎn)和試驗(yàn)研究應(yīng)采用生根繼代的方法進(jìn)行地錦試管苗繁殖。

現(xiàn)在用于生產(chǎn)的試管苗一般都采用莖尖等培養(yǎng)方法獲得,而不采用愈傷組織的方法獲得試管苗。這是因?yàn)楹芏嘌芯空哒J(rèn)為,愈傷組織容易發(fā)生變異,遺傳的穩(wěn)定性差[8,9],在本研究中由嫩莖愈傷組織獲得的試管苗遺傳性穩(wěn)定,沒(méi)有發(fā)生變異。這說(shuō)明在通過(guò)組織培養(yǎng)建立的無(wú)性系研究中,所獲得試管苗是否能保持遺傳的穩(wěn)定性,與所用試材和采用的研究方法有關(guān)。

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