拮抗草莓灰霉病菌的內生細菌SL2的分離及鑒定

李 娜

摘要從草莓健康葉片中分離到27株內生細菌,與草莓灰霉病菌的對峙試驗測定結果表明,其中有3株對草莓灰霉病菌具有顯著拮抗作用。且SL2的抑菌效果最為明顯,其抑菌半徑達到14mm,通過對其進行形態、生理生化特性及16S rDNA序列等方面的研究,初步鑒定SL2為地衣芽孢桿菌。

關鍵詞內生細菌;草莓灰霉病菌;地衣芽孢桿菌;16S rDNA

中圖分類號 Q93-331 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)21-0296-01

內生菌存在于健康植株中,能夠通過占據有利的生態位點來防止病原菌的入侵[1],并兼具克服附生細菌定植能力差、防效不穩定等特點,因此具有拮抗作用的內生菌是生物防治的潛在資源[2]。草莓灰霉病發生在草莓的開花后期和采收期,嚴重危害到其產量和質量[3],雖然使用化學農藥能夠減輕這種危害,但其造成的環境污染及果實中農藥殘留超標等副作用也日益引起人們的關注。因此,分離篩選有拮抗作用的內生細菌對防治草莓灰霉病有極其重要的意義。

1材料與方法

1.1供試材料

供試病原菌為草莓灰霉病菌。內生細菌分離,從草莓基地采集草莓葉片,經嚴格的表面消毒,組織勻漿后稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上,37℃培養3～5d。挑取大小、顏色、形態不同的菌落,純化得單菌落。

1.2拮抗菌的篩選

采用對峙培養法,取直徑為8mm的病原菌餅置于PDA平板(Φ90mm)中央,用接種環挑取純化好的菌種點接在距平板中央3cm處的4個角點上,25℃培養7d后測量抑菌帶寬。每處理設3個重復。選出對病原菌生長有抑制作用,且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株。

1.3拮抗菌的形態及生理生化鑒定

拮抗細菌的形態、培養性狀和生理生化特性測定參考《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊鑒定》[4,5]。

1.416S rDNA 的PCR擴增和序列分析

抽提拮抗菌總DNA,利用16S rDNA 細菌通用引物16SR1 (AGAAAGGAGGTGATCCAGCC);16SF1(AGAGTT TGA-TCC TGGCTCAG)進行PCR 擴增。擴增產物回收,送至上海生工生物科技公司測序。測序結果用Blast軟件在GenBank中進行同源性比較。

2結果與分析

2.1內生菌拮抗活性

從草莓葉片中共分得27株細菌,其中3株有拮抗活性,SL2有明顯的抑菌帶(見圖1)。抑菌半徑達14mm。

2.2拮抗內生細菌的形態特征和生理生化特性

SL2菌株形態特征:淺黃色、不規則、邊緣皺縮、不透明;革蘭氏染色呈陽性、桿菌i;有芽孢。SL2菌株生理生化特性見表1。

2.3菌株SL2的16S rDNA序列分析

菌株SL2的16S rDNA PCR產物長度為1 100bp,用ClustalX程序對菌株SL2的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進行比對分析,結果發現,SL2與acillus licheniformis strain CICC 10181(GQ375235)序列相似度達99%,結合生理生化鑒定結果,可初步鑒定菌株SL2為地衣芽孢桿菌。

3結論與討論

據報道,從植物體內分離篩選到的內生細菌多具有防病、促生等作用,可用于生防制劑的開發應用[2,6]。試驗從草莓葉片中分離具有較高拮抗作用的地衣芽孢桿菌SL2,具有生防菌株的潛力,但對其作用機制還有待進一步的研究,以期能為生物防治獲得較好的活性物質。

4參考文獻

[1] HALLMANN J,QUADT-HALLMANN W F,MAHAFFEE A,et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J].Can J Microbiol,1997,(43):895-914.

[2] 何紅,蔡學清,洪永聰,等.辣椒內生細菌的分離及拮抗菌的篩選[J].中國生物防治,2002,18(4):171-175.

[3] FARVIS W R. The Biology of Botrytis[M].Academic Press,1980.

[4] BUCHANAN RE,GIBBONS N E.伯杰細菌鑒定手冊(第八版)[M].北京:科學出版社,1984.

[5] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[6] 袁軍,孫福在,田宏先,等.防治馬鈴薯環腐病有益內生細菌的分離和篩選[J].微生物學報,2002,42(3):270-274.