熱休克蛋白70在賽來昔布聯合熱療治療胰腺癌中的作用

劉麗燕 王興鵬 姜立新 吳愷 楊佳芳

熱休克蛋白70在賽來昔布聯合熱療治療胰腺癌中的作用

劉麗燕 王興鵬 姜立新 吳愷 楊佳芳

熱休克蛋白(HSP) 又被稱為是“伴侶蛋白”，它在細胞生長、發育、分化、基因轉錄等功能方面發揮重要作用，在多種腫瘤細胞表面都有它過度表達的現象[1]。近年來的研究發現，HSP參與機體特異的抗腫瘤免疫反應[1]，且HSP表達量與腫瘤免疫原性強弱密切相關[2]，與腫瘤的惡性程度及患者的預后密切相關[3]。

我們前期的研究證實，熱療聯合賽來昔布可抑制胰腺癌細胞增殖，抑制移植瘤的生長[4]。本文報道HSP70在熱療聯合賽來昔布治療胰腺癌中所起的作用。

一、材料與方法

1．HSP70蛋白檢測：人胰腺癌細胞株SW1990細胞常規培養后分為4組：對照組、熱療組、賽來昔布組及熱療聯合賽來昔布組(聯合組)。處理方法同我們以前報道[4]。熱療為細胞置44℃ 1 h，賽來昔布終濃度為100 μmol/L。培養24 h后胰酶消化，離心收集各組細胞，提取總蛋白，行Werstern blotting。以β-actin作為內參。小鼠抗人HSP70單抗1∶200稀釋，小鼠抗人β-actin單抗1∶200稀釋。

2．HSP70 mRNA檢測：收集上述各組細胞，常規提取總RNA。按逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒說明書操作。引物序列：HSP70上游5′-CAGGTGATCAACGACGGAGACA-3′，下游5′-GTCGATCGTCAGGATGGACACG-3′，擴增片段365 bp；內參GAPDH上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴增片段223 bp。先逆轉錄獲得cDNA，后行PCR反應。PCR參數：94℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃(HSP70)或58℃(GAPDH)30 s，72℃延伸1 min。25個循環后，72℃延伸5 min。PCR反應產物置1.5%瓊脂糖凝膠電泳。采用美國GeneGenius凝膠電泳成像系統觀測，實驗重復3次。

3．移植瘤組織HSP70蛋白表達的檢測：裸鼠胰腺癌移植瘤制備及分組同我們以前報道[4]。實驗結束后處死裸鼠取移植瘤組織，常規固定、包埋、切片、免疫組化染色，光鏡下觀察。

4．移植瘤組織HSP70 mRNA 檢測：收集上述各組移植瘤組織，常規抽提總mRNA，同上述RT-PCR方法檢測HSP70 mRNA表達，以GAPDH為內參。

二、結果

1．SW1990細胞HSP70 mRNA和蛋白的表達：各組均有HSP70mRNA和蛋白的表達，但熱療組和聯合組較賽來昔布組及對照組增強(圖1、2)。

2．裸鼠移植瘤組織HSP70 mRNA和蛋白的表達：各組腫瘤組織均見HSP70 mRNA和蛋白的陽性表達，其中熱療組和聯合組的表達明顯強于對照組和賽來昔布組(圖3、4)。

圖1對照組(1)、賽來昔布組(2)、熱療組(3)和聯合組(4)SW1990細胞HSP70 mRNA的表達

圖2對照組(A)、賽來昔布組(B)、熱療組(C)和聯合組(D)SW1990細胞HSP70蛋白的表達

圖3對照組(1)、賽來昔布組(2)、熱療組(3)和聯合組(4)裸鼠移植瘤HSP70 mRNA的表達

圖4對照組(A)、賽來昔布組(B)、熱療組(C)和聯合組(D)移植瘤組織HSP70蛋白表達(免疫組化 ×400)

討論近年來的研究顯示，HSP70與抗腫瘤活性密切相關，其免疫機制表現為[5]：(1)HSP70與腫瘤細胞內的特異性抗原肽結合形成多肽復合物，通過抗原提呈細胞 (樹突狀細胞、巨噬細胞)表面的特異性高親和受體，介導抗原肽進入抗原提呈細胞，與胞內MHC分子形成復合物，并在抗原提呈細胞表面呈現，被α、βT細胞識別，激發抗腫瘤細胞特異性反應。HSP70還可以促進Th細胞向Thl細胞轉化，調整腫瘤患者機體的免疫狀態；(2)通過激活CTL(CD8+)細胞殺傷腫瘤細胞；(3)NK細胞無需致敏、補體激活和抗原誘導，可以通過識別MHC類樣分子(如HSP70家族蛋白)而發揮作用，還可以通過細胞毒性作用殺傷一些腫瘤細胞[6]；(4)HSP70可作為抗原遞呈分子，將腫瘤抗原呈遞到細胞表面，使γ、δT細胞活化，從而發揮殺傷細胞效應；(5)通過誘導PBMCs和γ、δT細胞產生多種細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IFN-γ)達到抑制腫瘤細胞生長及殺傷腫瘤細胞的目的[7]；(6)HSP70還可以活化補體系統，發揮抗腫瘤的作用。

本研究結果顯示，熱療組和熱療聯合賽來昔布組HSP70mRNA和蛋白的表達較賽來昔布組及對照組明顯上調。因HSP表達量多少與腫瘤免疫源性強弱密切相關[2]，HSP表達越多，其免疫源性越強，則其誘導的機體免疫反應相應越明顯，提示在熱療組和聯合組中HSP70的高表達通過上述機制誘導的機體免疫反應也相對更強，這可能是賽來昔布對胰腺癌熱療協同殺傷作用的一個機制。

[1] Kramer G,Steiner GE,Grobl M,et al.Response to sublethal heat treatment of prostatic tumor cells and of prostatic tumor infiltrating T-cells.Prostate,2004,58:109-120.

[2] Melcher A,Todryk A,Hardwick N,et al.Tumor immumogenicity is determined by the mechanism of cell death via induction heat shock protein expression.Nat Med,1998,4:581-587.

[3] 王群偉,楊竹林,李永國,等.胰腺癌細胞中HSP70和HSP60表達及意義.中華中西醫雜志,2003,4:10-11.

[4] 劉麗燕，王興鵬，姜立新,等.賽來昔布聯合熱療治療胰腺癌的研究.中華胰腺病雜志，2008，8:31-34.

[5] Ciupitu AM,Petersson M,Kono K,et al.Immunization with heat shock protein 70 from methlcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell response.Cancer Immunol Immunother,2002,51:163-170.

[6] Casey DG,Lysaght J,James T,et al.Heat shock protein derived from a non-autologous tumour can be used as an anti-tumour vaccine.Immunology,2003,110:105-111.

[7] 王笑虹，苗迎秋，宋光.熱休克蛋白70生物學功能研究的新進展.大連大學學報,2003,24:103-105.

2008-08-29)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.017

200080 上海，上海交通大學附屬第一人民醫院消化科(劉麗燕、吳愷、楊佳芳)；同濟大學醫學院附屬第十人民醫院消化科(王興鵬)；上海交通大學附屬第六人民醫院B超室(姜立新)

王興鵬，Email：xpwcn@public7.sta.net.cn