利谷隆對大鼠Leydig細胞睪酮合成影響及其機制研究*

丁宏偉，陽志文，胡曦尹，胡斌麗，李　巖

(遵義醫學院公共衛生學院衛生毒理學教研室，貴州遵義 563099)

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利谷隆對大鼠Leydig細胞睪酮合成影響及其機制研究*

丁宏偉，陽志文，胡曦尹，胡斌麗，李巖△

(遵義醫學院公共衛生學院衛生毒理學教研室，貴州遵義 563099)

[摘要]目的探討利谷隆對SD大鼠體外培養睪丸間質細胞(Leydig細胞)睪酮合成的影響及其可能的機制。方法采用SD大鼠睪丸間質細胞體外原代培養體系，利谷隆染毒劑量為0、50、100、200 μmol/L。放射免疫法測定睪酮水平，實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測Leydig細胞的細胞色素P450側鏈裂解酶(P450scc)、3β-羥基固醇脫氫酶(3β-Hsd)的mRNA表達，ELISA檢測利谷隆染毒24 h后Leydig細胞P450scc、3β-Hsd蛋白表達情況。結果利谷隆染毒各組睪酮水平下降，其中100、200 μmol/L組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，并有劑量依賴趨勢。與對照組比較，利谷隆染毒各組P450scc和3β-Hsd mRNA表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，有劑量依賴趨勢。利谷隆染毒各組3β-Hsd的蛋白表達降低，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；但P450scc蛋白表達與對照組比較，利谷隆染毒各組差異均無統計學意義(P>0.05)。結論利谷隆可導致大鼠Leydig細胞睪酮分泌量下降，其可能是通過抑制P450scc和3β-Hsd基因的表達，從而影響睪酮合成所致。

[關鍵詞]利谷隆；間質細胞；睪酮；P450側鏈裂解酶；3β-羥基固醇脫氫酶

近幾年來，環境抗雄激素(antiandrogens)物質對人類的生物學效應已經受到了廣泛關注，越來越多的實驗結果及流行病學資料表明：環境抗雄激素物質具有生殖與發育毒性，主要表現為男性精子質量下降及數量減少、生殖系統發育異常、生殖腫瘤等，但對其作用機制的認識很有限[1-3]。利谷隆(linuron)是一種廣泛使用在種植大豆、玉米、棉花、胡蘿卜、小麥、花生、甘蔗、果樹等地里的取代脲類低毒農藥除草劑，是一種比較弱的抗雄激素物質[4]。白建偉等[5]實驗發現，大鼠孕期暴露利谷隆可導致雄性子代永久性的性分化和性發育異常，包括肛門與生殖器距離縮短、附睪畸形等。睪丸間質細胞(Leydig細胞)合成和分泌雄激素，它是男性生殖系統發生、分化和成熟的基礎。已知雄激素依賴的信號和下游事件不僅涉及發育過程，也涉及疾病過程，諸如先天性尿道下裂和前列腺癌。最近，循環雄激素對誘導沃爾夫管(Wolffian duct)穩定性和接著形成的附睪及前列腺形成、生殖結節的雄性化和其他雄性特征也顯示有重要作用[6]。因此，本研究在建立大鼠Leydig細胞體外培養模型的基礎上，觀察利谷隆對Leydig細胞睪酮合成的影響，測定睪酮生成過程中起非常重要作用的細胞色素P450側鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage，P450scc)和3β-羥基固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-Hsd)基因的表達情況。目的是探討利谷隆是否影響Leydig細胞合成睪酮、睪酮合成是否與P450scc和3β-Hsd兩種酶基因表達有關，為進一步的機制研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：清潔級雄性SD 大鼠，體質量200 g左右，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。主要儀器與試劑：倒置顯微鏡(日本Olcanon公司)，Fisher scientific培養箱(美國Thermo公司)，DU-600型紫外分光光度計(德國BECKMAN公司)，FTC2000實時熒光定量基因擴增儀(加拿大FUNGLYN公司)，ELX800型酶標檢測儀(美國BIO-TEK公司)，中科大GC-2010型γ計數器。改良Eagle培養基購于美國Gibco公司，利谷隆購于Chemservice公司，二甲基亞砜(DMSO)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氮藍四唑(NBT)、雄甾烷、膠原酶I、胰蛋白酶均購于Sigma公司，Real-time qPCR相關試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司，ELISA試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司，睪酮放射免疫試劑盒購于北京北方生物技術研究所，其他實驗室常備試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1實驗分組與利谷隆染毒液的配制準確稱取0.40 mol(0.099 6 g)利谷隆，加1 mL DMSO溶解后再加培養液定容至10 mL即為40 mmol/L的利谷隆液，再取1 mL 40 mmol/L的利谷隆液用培養液定容至100 mL，即為400 μmol/L的利谷隆液，再分別稀釋成200、100、50 μmol/L的3個實驗組，對照組為0.1% DMSO。

1.2.2Leydig細胞的分離培養與純化

1.2.2.1Leydig細胞分離培養Leydig細胞的分離培養方法參照文獻[7]。取清潔級雄性SD大鼠，頸椎脫臼法處死。鼠體置于75%乙醇中浸泡5 min，然后置于超凈臺里預先備好的培養皿中，用中剪剪開下腹部皮膚，用眼科剪從附睪部剪斷精索，取出睪丸，放入含預冷PBS液的培養皿中洗滌2次，在冰面上剝除睪丸被膜和較大血管，保持睪丸形態的完整和曲細精管的連續性。置于錐形瓶中，加入適量的0.1%膠原酶Ⅰ。37 ℃、100次/分振蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細精管間組織松散，但曲細精管連續而無明顯斷裂。加入等體積的培養液終止消化，用400目(30 μm)不銹鋼濾網過濾。濾液經1 500 r/min離心5 min，去上清液，細胞沉淀于離心管底。DMEM-F12培養液重懸沉淀，充分吹打，使細胞懸液混勻。取一滴細胞懸液，用0.4%的臺盼藍染液染色，計數活細胞數量。接種細胞于25 mL培養瓶中(37 ℃、5%CO2)。

1.2.2.2Leydig細胞純化采用2 h差速貼壁法，即：細胞培養2 h后，棄去培養液，PBS 液沖洗2次。加入DMEM/F12培養液(含5%胎牛血清)5 mL 每瓶，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。倒置顯微鏡下觀察Leydig細胞貼壁情況。

1.2.2.3Leydig細胞純度鑒定將20 mg NAD、2 mg雄甾烷和2 mg NBT用PBS溶液配成10 mL 3β-Hsd染色劑。Leydig細胞培養24 h后，將培養液吸出，加入3β-Hsd染色劑，培養箱孵育1 h后倒置顯微鏡下觀察并攝片。分離細胞成活率為97%以上，培養24 h后其存活率在95%以上，Leydig細胞的純度在90%以上。

1.2.3檢測指標與方法(1)放射免疫法檢測Leydig細胞睪酮分泌水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。(2) ELISA檢測Leydig細胞P450scc和3β-Hsd蛋白表達，嚴格按照各試劑盒說明書提供的檢測步驟進行檢測。(3)實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測Leydig細胞P450scc和3β-Hsd mRNA的表達(表1)。結果分析處理(相對定量法)，以Ct值為統計參數依次計算下列數據：

Ct平均值=(Ct1+Ct2)/2(重復管)

(1)

△△Ct=(Ct目的-Ct內參)實驗組-(Ct目的-Ct內參)對照組

(2)

目的基因相對于某基因的表達量=2-△△Ct

(3)

表1　　Real-time PCR的引物序列表

2結果

2.1原代培養間質細胞的形態學觀察及純度鑒定結果倒置顯微鏡下觀察，經差速貼壁法獲得的Leydig細胞貼壁鋪展后主要為長梭形、圓形和多角形(圖1)。采用3β-Hsd特異性酶學染色后，Leydig細胞在伸展狀態下均可見細胞質內藍黑色陽性反應，且任意視野下計數Leydig細胞超過90%，見圖2。

A：Leydig細胞(×100)；B：Leydig細胞(×400)。

A：Leydig細胞(×100)；B：Leydig細胞(×400)。

2.2利谷隆對Leydig細胞睪酮分泌水平的影響各組間做方差分析，總體差異有統計學意義(F=6.982，P=0.003)。與對照組比較，利谷隆50 μmol/L組睪酮分泌水平相近(P>0.05)；100、200 μmol/L組睪酮分泌水平下降(P<0.05)，見圖3。經線性相關分析，睪酮水平與利谷隆染毒劑量呈負相關(r=-0.732，P<0.05)。

a:P<0.05，與對照組比較。

2.3利谷隆對Leydig細胞P450scc mRNA表達的影響各組間做方差分析，總體差異有統計學意義(F=14.113，P<0.001)。與對照組比較，利谷隆50 μmol/L組P450scc基因表達相近(P>0.05)；100、200 μmol/L組P450scc基因表達下降(P<0.05)，見圖4。

2.4利谷隆對Leydig細胞3β-Hsd mRNA表達的影響各組間做方差分析，總體差異有統計學意義(F=3.334，P=0.04)。與對照組比較，利谷隆各劑量組3β-Hsd基因表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

a:P<0.05;b:P<0.01，與對照組比較。

2.5利谷隆對Leydig細胞P450scc蛋白表達的影響各組間做方差分析，總體差異無統計學意義(F=0.90，P=0.458)，見圖6。

圖6　　各組Leydig細胞的P450scc蛋白表達比較

2.6利谷隆對Leydig細胞3β-Hsd蛋白表達的影響各組間做方差分析，總體差異有統計學意義(F=7.179，P=0.02)。與對照組比較，利谷隆各劑量組3β-Hsd蛋白表達均下降(P<0.05)，見圖7。經線性相關分析，3β-Hsd蛋白表達量與利谷隆染毒劑量之間呈負相關(r= -0.703，P<0.05)。

a:P<0.05;b:P<0.01，與對照組比較。

3討論

Juul等[8]研究表明，利谷隆能引起受孕的雄性子代性分化異常，并且可使性發育異常加重，主要表現為尿道下裂、隱睪等。已知小鼠在孕12.5 d(E12.5)～13.5 d(E13.5)時由間質細胞分化為Leydig細胞，并合成睪酮[6]。短期體內實驗利谷隆能降低雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)和睪酮依賴組織質量，并改變由雄激素調節的腹側前列腺基因表達[9]。

本研究通過整體動物實驗發現胚胎期染毒利谷隆能夠干擾雄性子代體內睪酮的代謝，導致睪酮分泌不足。為進一步探討及驗證利谷隆對Leydig細胞分泌睪酮的影響，采用原代培養的大鼠Leydig細胞作為實驗對象，觀察利谷隆作用后其睪酮分泌功能的變化。本實驗發現，隨著利谷隆染毒劑量的增加，Leydig細胞睪酮分泌量下降，且在利谷隆100、200 umol/L組開始顯著下降，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。本研究中利谷隆對Leydig細胞合成睪酮的影響與上述整體動物實驗結果相符。

研究表明，睪酮是由膽固醇經一系列酶催化而生成[10-13]。膽固醇從線粒體外膜轉運至線粒體內膜(StAR在此過程中起著重要調節作用)，接著膽固醇裂解為孕烯醇酮(由P450scc催化)，進而孕烯醇酮由3β-Hsd催化變成孕酮，這3個反應是睪酮合成的限速步驟。Raucci等[14]研究表明，P450scc活性降低可能引起睪酮合成水平下降。為了進一步揭示睪酮合成下降的機制，本研究利用Real-time qPCR法測定利谷隆染毒對Leydig細胞P450scc和3β-Hsd mRNA表達的影響。實驗結果表明，利谷隆各染毒組Leydig細胞的P450scc和3β-Hsd mRNA表達都明顯低于對照組，說明利谷隆能夠降低睪丸Leydig細胞中睪酮合成關鍵酶基因P450scc和3β-Hsd活性表達。進一步用ELISA方法表明利谷隆還可影響3β-Hsd的蛋白表達，使3β-Hsd 蛋白表達明顯下降。盡管利谷隆對Leydig細胞的P450scc基因表達有抑制作用，但P450scc蛋白表達與對照比較差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與觀察時間不夠有關。陶曉倩等[15]在研究膜聯蛋白5對大鼠睪丸Leydig細胞睪酮合成相關蛋白和酶表達的影響時也觀察到3β-Hsd表達改變較P450scc蛋白表達早。因此，推測進一步延長觀察時間可能對P450scc蛋白也有抑制作用。本實驗結果表明，利谷隆可影響體外培養的大鼠睪丸Leydig細胞睪酮的合成，其機制可能是通過抑制雄激素合成代謝酶P450scc和3β-Hsd 的表達，從而降低睪酮激素水平。至于利谷隆是如何抑制雄激素合成代謝酶基因表達的機制有待進一步研究。

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doi:·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.027

基金項目：貴州省科技廳自然科學基金資助項目(C-341)；貴州省教育廳重點課題資助項目(C-413)；貴州省省長基金資助項目(C-351)；遵義市科技局資助項目(E-144)；遵義醫學院博士啟動基金項目資助(F-205)。

作者簡介：丁宏偉(1991-)，碩士研究生，主要從事金屬與生殖毒理學研究。△通訊作者，E-mail：liyan067321@sina.com。

[中圖分類號]R114

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)18-2535-04

(收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-03-03)