植物脂質轉運蛋白的研究

李長生　趙傳志　李愛芹　李興圃　趙光敬　王興軍

摘要：植物脂質轉運蛋白(Lipidtransfer protein，LTP)是一類小分子堿性蛋白，占植物可溶性總蛋白的4％左右，目前已經在許多植物中克隆了LTP的編碼基因。LTP是一種多功能的蛋白，除了被認為參與了磷脂在生物膜之間的運輸外，LTP還在生物膜、角質和脂質的形成、植物的生殖發(fā)育以及信號的轉導等生物過程中發(fā)揮了重要的作用，另外LTP作為一種食物過敏原和防御蛋白引起了科研人員越來越多的興趣。本文綜述了LIP的生物學功能，對LTP在農業(yè)上的應用前景做了展望。

關鍵詞：脂質轉運蛋白；過敏原；植物防御

中圖分類號：Q946.1文獻標識號：A文章編號：1001—4942(2009)08—0013—05

脂質轉運蛋白(upid transfer protein,LTP)，又被稱為磷脂交換蛋白(Phosphdi，did@xchangeprotein，PIEP)，1975年首次在馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)，是一類分子量為7～11 ku的堿性小分子蛋白。植物中LTP含量高，占可溶性蛋白的4％左右，被認為是植物生命活動的一種重要活性蛋白。在1998年第五屆國際植物病程相關蛋白專題研討會上，LTP被列入植物病程相關蛋白(PRs)家族，并被命名為PR—14。LTP在植物中普遍存在，目前關于LTP在擬南芥、玉米、水稻、棉花、小麥、番茄、辣椒、油菜等作物和蔬菜中的研究比較深入。LTP的生物學功能呈現(xiàn)出多樣性和復雜性，LTP基因也存在多態(tài)性。LTP基因在植物中屬于一個小的多基因家族，從辣椒中已經分離到6個LTP基因，擬南芥中分離到15個LTP基因，水稻全基因組測序發(fā)現(xiàn)了53個非特異LTP基因，這些不同的LTP基因編碼相似的蛋白，但是不同的LTP基因的表達模式不盡相同。除了被認為能在離體條件下參與磷脂、脂肪酸、糖脂等在生物膜之間的運輸外，LTP還在生物膜、角質和脂質的形成，植物的生殖發(fā)育以及信號的轉導等生物過程中發(fā)揮著重要的作用。作為一種防御蛋白，LTP在植物抵抗病原菌的侵染以及適應脅迫的環(huán)境中起著重要作用。因此，通過基因工程的手段過量表達LTP基因，增強作物的抗病和適應不良環(huán)境的能力，培育作物抗逆新品種，在實際生產中有重要意義。

1植物脂質轉運蛋白

1.1脂質和植物脂質轉運蛋白

脂質(1ipids)又稱類脂，是生物體中一大類不溶于水而溶于有機溶劑的有機化合物，主要包括脂肪酸、磷脂、糖脂、類萜、類固醇、蠟等。其中磷脂、糖脂等是植物葉綠體、線粒體等細胞器生物膜的重要組成成分，而葉綠體、線粒體等并沒有合成脂質的能力，Kader等在研究脂質是如何從合成之處轉運到這些受體細胞器的過程中發(fā)現(xiàn)了脂質轉運蛋白。LTPs在體外能夠可逆地結合和轉運多種疏水分子，如磷脂、糖脂、脂肪酸、乙酰輔酶A／類固醇、芳香衍生物及角質單體等脂類復合物。LTPs相對熱、化學變性、酶的消化穩(wěn)定性很高。LTPs蛋白的一級結構在不同物種中同源性不高，一般只有30％～70％氨基酸相同，但都具有LTP蛋白的結構和特性。LTPs N端一般都含有一個由21-29個氨基酸組成的信號肽序列，包含有8個半胱氨酸殘基，由4個保守的二硫鍵按照固定模式排列。根據(jù)分子量的大小LTP可以分為兩大類：LTP I和LTPⅡ，LTP I定位于細胞壁，分子量約為lO ku，由90～95個氨基酸組成，主要存在于植物地上部分的組織和器官；LTPⅡ分子量約為7 ku，由大約70個氨基酸組成，主要存在于根部。LTP I和LTPⅡ在N端都有一段信號肽序列，并且具有基本相同的二級結構。X射線晶體衍射和核磁共振研究表明LTP分子的三維結構具有一個向內的疏水腔，Kader推測LTPs疏水腔和磷脂分子酰基鏈的結合是實現(xiàn)磷脂在膜之間轉運的基礎。

1.2植物脂質轉運蛋白在細胞中的定位

植物LTP是一類胞外分泌型蛋白，在細胞內的定位比較復雜。對擬南芥、水稻、蓖麻的免疫細胞學研究表明，LTP定位于細胞壁上，并可能在內質網形成后全部進人內質網腔，然后通過高爾基體分泌到細胞外。

2植物脂質轉運蛋白基因及表達調控

2.1不同植物脂質轉運蛋白基因的克隆和序列分析

1986年，Mundy等從玉米中擴增到650個堿基的cDNA序列，同源比對后被定義為a-淀粉酶抑制子。1988年Tchang等通過構建玉米幼苗的eDNA文庫，篩選克隆了玉米LTP編碼基因的部分eDNA序列，這是對LTP編碼基因的首次明確報道，同時也證實Mundy等1986年克隆的a-淀粉酶抑制子編碼序列也是LTP基因。此后擬南芥、水稻、煙草、油菜等的LTP基因部分編碼序列相繼報道。截止到2009年5月7日，在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中登錄的編碼植物LTP基因的EST有4 850條，其中來自大豆的1726條，棉花548條，花生121條，煙草94條，擬南芥48條，水稻37條，番茄21條。為了進一步說明LTP基因的結構和特點，隨機選取以上幾個物種的LTP基因(見表1)，用DNAstar將這些基因的開放閱讀框(ORF)翻譯成氨基酸序列并預測了分子量的大小，結果表明這些LTP的分子量介于9.9～11.9 ku之間，推測均屬于LTP I家族。

用DNAMAN軟件和多序列比對軟件Clust-alW(1.83)分析表明，這10個LTPs基因氨基酸序列相似性為44.09％(圖1)，8個半胱氨酸殘基的數(shù)量和位置相同，而且c端的保守性相對N端要高。SignalP在線軟件(http://www.ebs.dtu.dk／serviees／SignalP／)分析結果表明，花生和棉花LTPs基因信號肽長度較短，只有20個氨基酸殘基，其它植物LTP基因的信號肽長度介于20-29個氨基酸之間，而且信號肽剪切位置相對固定。通過DNAsmr對以上LTPs基因進行親／疏水性分析，獲得了LTPs基因的親／疏水曲線(圖2)，表明LTPs基因的肽鏈具有較大的疏水面，特別是在N端有幾個連續(xù)的氨基酸殘基組成的疏水性肽段，從另一個側面說明這段序列具有信號肽的特征。

2.2植物脂質轉運蛋白基因的表達調控

不同物種LTP基因的表達模式不盡相同，同一物種中LTP基因的表達具有較強的發(fā)育和組織特異性。普遍認為LTP基因在幼嫩組織中比在老化組織中表達要強，在花的發(fā)育過程中LTP基因只在早期表達，在根中沒有表達。Thoma等證實LTP基因在擬南芥的花、角果和葉片中表達，在根中沒有表達。在擬南芥營養(yǎng)生長期，LTP基因在胚的表皮原細胞、微管組織、子葉頂端、莖尖的分生組織中表達；生殖生長期在嫩葉、莖、花、角果、子房外壁、柱頭、花瓣和萼片中均

有表達。Lee等研究發(fā)現(xiàn)LTP I基因在擬南芥的表皮、莖皮層、維管束、葉肉細胞、花粉及種子中均有表達，在根尖中也發(fā)現(xiàn)了LTP基因的表達，但不同組織中的表達量有明顯差異。

作為植物一種重要的防御蛋白，LTP基因的表達受到干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫因子的誘導。Maghuly等研究發(fā)現(xiàn)LTP基因能夠對低溫、高溫、高鹽、機械傷害作出應答，實時定量PCR結果顯示，在受到以上逆境因子誘導后LTP基因的表達量在葉片大幅上調。而在根中卻有輕微下調的趨勢。LTP基因對不同脅迫因子誘導的反應不盡相同，而且在同一植株不同組織和器官中表達情況也不一樣：例如在大麥中，低溫、干旱等不能誘導LTP基因的表達，而高鹽和脫落酸能夠誘導LTP基因的表達；被高鹽、高溫和脫落酸處理的番茄LTP基因只在莖中表達。LTP基因也能夠對病原菌的侵染和一些信號分子(水楊酸、脫落酸、乙烯等)作出響應，例如大麥接種病原真菌12 h后，LTP基因上調9倍。

3脂質轉運蛋白在植物抗逆中的作用

3.1植物脂質轉運蛋白和非生物脅迫

越來越多的證據(jù)表明LTP在植物抗逆和適應不良環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。Dirk等首次證明LTP蛋白是一種冷調節(jié)蛋白，在低溫脅迫下具有穩(wěn)定質膜的功能；Liu等在綠豆中克隆了2個LTP基因，Vrltpl和Vrltp2，證明LTP基因在水脅迫處理過程中有重要作用，且特異地存在于生長的莖組織中。盡管很多的分子機制還不是很清楚，但LTP基因對其它逆境因子(ABA、NaCl、甘露醇、PEG等)的應答反應，預示著LTP基因在植物抗逆(鹽堿、低溫、干旱)中扮演著重要角色。李誠斌等從巴西旱稻中克隆到全長的OsLTPl基因，構建過量表達載體轉化水稻日本晴，證明轉基因植株具有較強的耐鹽能力。

3.2植物脂質轉運蛋白和生物脅迫

LTP屬于植物病程相關蛋白(PRs)，它能被病原菌誘導而高水平表達，并能抑制病原菌的生長和誘導植物系統(tǒng)抗性的產生。越來越多的證據(jù)表明，LTPs在體外具有抗菌能力：Molina等將從大麥中純化的脂質轉運蛋白(LTP2)用基因槍轉人煙草的葉片，與對照相比病原細菌丁香假單胞桿菌在煙草葉片上的生長受到了明顯的抑制。Ge等通過水稻的LTPl0基因的原核表達，純化得到LTP蛋白，證明LTP蛋白在體外能有效地抑制稻瘟病菌孢子的萌發(fā)，而且在較低濃度(66 mg／L)下也可以發(fā)揮作用。

通過過量表達LTPs基因也能提高轉基因作物對病原菌的抗性：Rajesh等利用玉米泛素基因的啟動子驅動LTP基因，構建表達載體并轉化水稻，過量表達LTP基因的水稻能夠有效抑制稻瘟病菌、立枯病和水稻黃單胞菌的侵染，轉基因后代對水稻三大病害——稻瘟病、紋枯病和白葉枯病的抗病能力分別提高了86％、67％和82％。抑制LTPI和LTPⅡ基因的表達使辣椒容易受到茄科細菌性斑點病和胡椒斑點病毒的感染，而過量表達則增強了其對真菌病、煙草黑脛病、細菌病、煙草野火病的抗性”。表明LTPs基因在體內和體外都具有抗菌能力，不僅可以通過體外的途徑有效抑制植物病原菌的發(fā)作和流行，而且可以利用基因工程手段通過增強LTPs基因的表達來提高作物的抗病能力。

Molina等研究發(fā)現(xiàn)不同種的病原細菌和真菌對LTP的敏感程度不同，甚至同種不同株系間對LTP的敏感程度也存在差異；不同植物來源的LTP在體外抵抗微生物的能力也有明顯差異。例如洋蔥的LTPs具有廣譜的抗性，玉米和小麥的LTPs只有很低的抗微生物能力；同一植物來源的LTPs對不同植物病害的抵抗能力也不相同，如來源于蓖麻種子的LTPs對鐮刀茵、腐霉菌和絲核菌等真菌以及一些革蘭氏陽性細菌有明顯的抑制效果，但對一些革蘭氏陰性細菌沒有作用。Park等研究發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒侵染后，辣椒LTP基因的表達水平顯著提高，由此推測LTP可能有抗病毒的功能。

4植物脂質轉運蛋白在其它方面的研究進展

除上述功能外，LTPs還可能參與了生物膜、角質和脂質的合成。另外，LTPs和花粉的發(fā)育密切相關，Sang等研究發(fā)現(xiàn)LTP促進了百合花粉管和柱頭基質的粘合，是花粉黏附到柱頭基質的必需物質之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LTP在花粉的水合作用以及花粉管的伸長方面也起著重要作用。LTP還能提高細胞壁的伸展性，促進細胞壁的伸長；另外，在細胞程序化死亡過程中，LTPs起到了保護細胞免受蛋白酶水解的作用。LTP也參與了植物表皮層的形成，還是重要的過敏原。LTP在植物的生殖發(fā)育以及信號轉導等生物過程中也發(fā)揮了重要的作用。

5小結

脂質轉運蛋白在植物生命活動的很多方面行使著重要的生理、生化功能。近年來對LTP的研究取得了很大的進展，但仍有許多問題需要繼續(xù)深入研究。LTPs在脂質流傳遞的過程中轉運脂質的機制是什么?雖然科學家給出了幾個合理的假說，但一直沒有強有力的證據(jù)證明。關于LTPs的抗病機制研究也存在很多爭論，假說一認為脂質轉運蛋白可能干擾了激發(fā)素觸發(fā)的植物細胞致死性過敏反應；假說二認為LTP通過可能的信號傳遞途徑以及參與角質屏障的形成來增強植物的防御機能，另外還有研究證明LTPs自身對真菌也有一定的致死能力，是不是多種機制的協(xié)同作用還有待進一步研究。隨著研究的深入，LTPs將在生物農藥的開發(fā)、作物抗逆、抗病育種中發(fā)揮越來越重要的作用。