雙T-DNA共轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因番木瓜

摘要：番木瓜采后期間的迅速軟化現(xiàn)象，導(dǎo)致果實(shí)的貨架期十分短暫：利用RNAi-β-Gal雙T-DNA植物表達(dá)載體p2301／TTRG，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，探索了液體振蕩轉(zhuǎn)化法和浸泡轉(zhuǎn)化法對(duì)番木瓜胚性愈傷組織共轉(zhuǎn)化效率的影響。經(jīng)抗生素敏感性測(cè)定，將卡那霉素篩選質(zhì)量濃度確定為150mg·L^-1。在該質(zhì)量濃度下，2種方法均獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，但轉(zhuǎn)化效率仍較低。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，浸泡轉(zhuǎn)化法中各處理因素的作用大小為：AS質(zhì)量濃度>共培養(yǎng)時(shí)間=菌液光密度值=侵染時(shí)間，最佳共轉(zhuǎn)化組合為：100μmol·LAS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培養(yǎng)3d。經(jīng)PCR和Soulhern雜交檢測(cè)，所獲得的5株冉生植株中有2株為共轉(zhuǎn)化的結(jié)果，誘導(dǎo)了其中1株生根并移栽。為進(jìn)一步選育無(wú)選擇標(biāo)記基因的抗軟化轉(zhuǎn)基因番木瓜奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番木瓜；果實(shí)軟化；雙T-DNA；共轉(zhuǎn)化植株

中圖分類號(hào)：S667.97

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2010)03-397-07

番木瓜(CarCA papaya L.)原產(chǎn)南美洲，在熱帶、亞熱地區(qū)帶地廣泛種植。然而，番木瓜環(huán)斑病毒病(PRSV)的危害給番木瓜種植業(yè)帶來(lái)了毀滅性的打擊。美國(guó)夏威夷大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員首先利用基因槍，將PRSV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入番木瓜基因組中，培育出了全球首例的轉(zhuǎn)基因果樹(shù)，并進(jìn)入商品化生產(chǎn)。隨后，研究者們圍繞番木瓜的轉(zhuǎn)基因抗病育種，開(kāi)展了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)為主，旨在提高番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的探索性工作，大大推動(dòng)了番木瓜轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)程。然而，有研究表明，轉(zhuǎn)基因番木瓜的種植，明顯提高了其周?chē)寥乐形⑸锶郝鋵?duì)抗生素的抗性。因此，培育對(duì)環(huán)境友好，同時(shí)也是對(duì)人類健康的轉(zhuǎn)基因番木瓜顯得意義重大。

作為呼吸躍變型果實(shí)，番木瓜采后壽命短，不易貯藏保鮮。前人已從番木瓜果肉中分離和鑒定了ACO和ACS基因，并進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)反義基因的研究，擬通過(guò)調(diào)控果實(shí)內(nèi)源乙烯的生物合成，延長(zhǎng)果實(shí)的貨架期。以果實(shí)細(xì)胞壁中關(guān)鍵的水解酶基因作為沉默的靶標(biāo)。是選育生理上能夠正常成熟的抗軟化轉(zhuǎn)基因番木瓜的另一途徑。我們利用與番木瓜果實(shí)后熟軟化密切相關(guān)的β-GaL基因(GenBank AccessionN0，AF064786)，構(gòu)建了RNAi-β-Gal雙T-DNM單質(zhì)粒系統(tǒng)植物表達(dá)載體p2301／TTRGt。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化番木瓜胚性愈傷組織，并誘導(dǎo)體胚發(fā)生和植株再生，獲得了分子檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因番木瓜。以期在高效沉默番木瓜內(nèi)源目的基因的同時(shí)，獲得選擇標(biāo)記基因與外源基因表達(dá)盒不連鎖的轉(zhuǎn)基因植株，為今后選育無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因番木瓜奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

選用漳紅番木瓜葉片和葉柄所誘導(dǎo)的CⅡb型胚性愈傷組織為材料。以含有植物表達(dá)載體p2301／TTRG(圖1)的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105進(jìn)行侵染，進(jìn)行番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)基因植株再生的研究。

1.2 方法

1.2.1 番木瓜胚性愈傷組織卡那霉素(Kan)敏感性測(cè)定選取長(zhǎng)勢(shì)良好的2種胚性愈傷組織，分別接種于含有不同Kan濃度(50、100、150、200、250、300mg·L^-1)的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基[改良MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.5mg·L^-1KT+400mg·L^-1Glu(谷氨酰胺)+30g·L^-1蔗糖]上，以接種于無(wú)Kan培養(yǎng)基的愈傷組織作為對(duì)照。每個(gè)Kan濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3瓶，每瓶接種4個(gè)約0.5g的愈傷組織，分別記錄接種0d、15d、30d和45d時(shí)每個(gè)重復(fù)中2種愈傷組織的質(zhì)量。根據(jù)不同時(shí)期愈傷組織較0d時(shí)的質(zhì)量增長(zhǎng)率制作生長(zhǎng)曲線，分析不同Kan濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用，確定最佳的抗生素選擇壓。

1.2.2 農(nóng)桿菌工程菌液的制備 挑取含有植物表達(dá)載體p2301／TTRG的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，至50mL含100 mg·L^-1Kan、100mg·L^-1Str(鏈霉素)和10μmoI·L^-1AS(乙酰丁香酮)的YEB培養(yǎng)基中，于28℃搖床中225 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h。將菌液于3 000r·min^-1室溫離心后，用等體積的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，并加入AS至相應(yīng)終濃度，225r·min^-1振蕩培養(yǎng)3h，用MS液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至工作濃度。

1.2.3 番木瓜胚性愈傷組織液體振蕩轉(zhuǎn)化法 參照Dhekney等的方法，每個(gè)重復(fù)約200gCⅡb型胚性愈傷組織。先將愈傷組織接種于含0.1g·mL^-1石英砂的MS液體培養(yǎng)基中，180r·min^-1，室溫振蕩30min，創(chuàng)傷外植體。之后，轉(zhuǎn)接至液體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS+2.0mg·L^-12，4-D+400mg·L^-1Glu+60g·L^-1蔗糖)，接種比例約為0.2g·mL^-1液體培養(yǎng)基，并向其中加人農(nóng)桿菌工程菌液(100μmol·L^-1AS，D^600mm=1.0)，接種量為0.06 L·L^-1液體培養(yǎng)基。于黑暗條件，125r·min^-1，28℃共培養(yǎng)3d。之后，轉(zhuǎn)接至含有500mg·L^-1Carb(羧芐青霉素)的液體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1個(gè)月，每10d更換1次培養(yǎng)基。接著，轉(zhuǎn)接至含300mg·L^-1Carb和150mg·L^-1Kan的固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至少5個(gè)月，篩選抗性愈傷并誘導(dǎo)體胚發(fā)生，其間每20d繼代1次。體胚發(fā)生后，將單個(gè)體胚分離至含200mg·L^-1Carb和50mg·L^-1Kan的固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2個(gè)月誘導(dǎo)體胚成熟。之后，將子葉型體胚轉(zhuǎn)移至含200mg·L^-1Carb的固體增殖培養(yǎng)基[MS+0.2mg·L^-1BA+0.02mg·L^-1NAA+20mg·L^-1ADS(硫酸腺嘌呤)+30g·L^-1蔗糖]上誘導(dǎo)體胚萌發(fā)以及成苗。分離體胚莖尖并轉(zhuǎn)接至含100mg·L^-1Carb和50 mg·L^-1Kan的固體增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。之后在含1／2MS+0.5mg·L^-1IBA+1g·L^-1AC(活性炭)+30g·L^-1蔗糖的固體生根培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)至1／2MS+1g·L^-1AC+30 g·L^-1蔗糖的固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，待植株生根后進(jìn)行煉苗和移栽。最終統(tǒng)計(jì)并計(jì)算體胚發(fā)生率(發(fā)生體胚外植體數(shù)／接種數(shù))、轉(zhuǎn)化率(陽(yáng)性體胚數(shù)／接種數(shù))、共轉(zhuǎn)化率(共轉(zhuǎn)化陽(yáng)性體胚數(shù)／接種數(shù))、污染率(污染外植體數(shù)／接種數(shù))和死亡率(死亡外植體數(shù)／接種數(shù))。

1.2.4 番木瓜胚性愈傷組織浸泡轉(zhuǎn)化法 以AS濃度、菌液光密度值、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)天數(shù)為試驗(yàn)因子，開(kāi)展4因素3水平的L₉(3⁴)正交試驗(yàn)(表1)。通過(guò)侵染CⅡb型胚性愈傷組織和共培養(yǎng)，在選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因番木瓜體胚發(fā)生和植株再生，優(yōu)化番木瓜雙T-DNA遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與分析。外植體經(jīng)共培養(yǎng)后，用無(wú)菌水沖洗6次，并在超凈工作臺(tái)中晾干。隨后的所有步驟同“液體振蕩轉(zhuǎn)化法”。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因番木瓜的PCR檢測(cè) 收集具Kan抗性番木瓜再生植株的葉片，以改良3×CTAB小量法提取基因組DNA。以植物表達(dá)載體p2031／TTRG上GUS基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否整合了選擇標(biāo)記基因所處的T-DNA區(qū)段，引物序列為：GPl：5′-CTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTG-3′，GP2：5′-GGATAGTCT-GCCAGTTCAGTTCC-3′，目的片段大小為350bp；同時(shí)，在p2031／TTRG上的正義β-Gal／基因和PDK內(nèi)含子之間設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否含有RNAi-β-Gal結(jié)構(gòu)，引物序列為：CHKPl：5′-GAGAATGAGTATGGACCTATFGAGTGG-3′，CHKP2：5′-CqTCTTCGTCTTACACATCACTFGTCA-3′，目的片段大小為833 bp；最終驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株是否為雙T-DNA共轉(zhuǎn)化的結(jié)果。以非轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒p2301／TTRG作為陽(yáng)性對(duì)照，分別進(jìn)行2種結(jié)構(gòu)的PCR檢測(cè)，將2種PCR產(chǎn)物于同一個(gè)點(diǎn)樣孔中進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，EB染色后拍照記錄。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因番木瓜的PCR-Southern雜交和Southern雜交檢測(cè)

以質(zhì)粒p2301／TTRG為模版。利用引物CHKPI和CHKP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，利用DIG DNA Labeling and Detection Kit(Roche)，標(biāo)記為探針。采用同樣的引物對(duì)共轉(zhuǎn)化番木瓜DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以非轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA和質(zhì)粒p2301／TTRG分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。將PCR檢測(cè)產(chǎn)物于1.0％的瓊脂糖中，70V電壓進(jìn)行電泳分離，利用毛細(xì)管虹吸法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，于80℃中2h烘干并固定DNA。雜交、洗膜以及顯色的具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，顯色后拍照記錄。

以質(zhì)粒p2301／TrRG為模板，利用引物PDKPl：5′TGACAAGTGATGTGTAAGACGAAG-3′和PD-KP2：5′-GTTACCTTGTI'TATFCATGTFCGACT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)561bp的PDK內(nèi)含子片段并回收，標(biāo)記為探針。將共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因番木瓜和非轉(zhuǎn)基因番木瓜的2種基因組DNA(約10μg)和質(zhì)粒p2301／TTRG，用HindⅢ于37℃酶切過(guò)夜。隨后步驟同上所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜胚性愈傷組織的抗生素敏感性測(cè)定

與對(duì)照相比，葉片和葉柄CⅡb型胚性愈傷組織接種于含Kan的培養(yǎng)基后，生長(zhǎng)速度明顯下降。在Kan濃度≥100 mg·L^-1的培養(yǎng)基上，接種45d時(shí)，2種愈傷組織的增長(zhǎng)量均較對(duì)照有明顯的下降。隨著Kan濃度的增加，愈傷組織在培養(yǎng)過(guò)程中的增重率呈逐步下降的趨勢(shì)(圖2，3)，在含300mg·L^-1Kan培養(yǎng)基上2種愈傷組織增長(zhǎng)量與對(duì)照的差異均達(dá)到極顯著水平。綜合考慮Kan對(duì)外植體生長(zhǎng)和體胚發(fā)生的抑制作用，將遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)所使用的Kan濃度定在150 mg·L^-1。

2.2 番木瓜胚性愈傷組織液體振蕩轉(zhuǎn)化法

2.2.1 具Kan抗性胚性愈傷組織的體胚發(fā)生和轉(zhuǎn)基因植株再生經(jīng)該法所處理的胚性愈傷組織，很少出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染的情況。將具有Kan抗性的胚性愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)2～3個(gè)月，進(jìn)一步誘導(dǎo)體胚發(fā)生。在2次重復(fù)試驗(yàn)中，分別有26.18％和21.59％的愈傷組織發(fā)生體胚(表2)。經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，多數(shù)體胚逐漸白化或褐化死亡。僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)生長(zhǎng)發(fā)育較為正常的體胚(圖版A)，將這些體胚轉(zhuǎn)移至不含Kan的增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體胚萌發(fā)(圖版B)。體胚萌發(fā)后，分離其莖尖轉(zhuǎn)接至含Kan的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月左右，篩選具Kan抗性的再生植株，發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)體胚再生植株的莖尖能夠在含Kan的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因番木瓜的分子檢測(cè) PCR檢測(cè)結(jié)果表明，該2株轉(zhuǎn)基因植株中，只有1株的基因組中同時(shí)含有GUS基因和RNAi-B-Gall結(jié)構(gòu)(圖4)。PCR-Southern雜交證實(shí)，共轉(zhuǎn)化植株中的RNAi-B-Go／結(jié)構(gòu)來(lái)自于p2301／TTRG(圖5)。p2301／TTRG上包含RNAi-β-Gal結(jié)構(gòu)的T-DNA區(qū)段含有2個(gè)HindⅢ位點(diǎn)(圖1)，經(jīng)HindⅢ酶切后的最小片完整地包含了PDK內(nèi)含子，與探針具有同源性。雜交后，共轉(zhuǎn)化植株泳道與陽(yáng)性對(duì)照最小雜交片段大小相近的位置出現(xiàn)了明顯的雜交信號(hào)(圖6箭頭處)，陽(yáng)性對(duì)照中呈現(xiàn)出多條雜交帶，非轉(zhuǎn)基因植株的泳道中則未出現(xiàn)雜交信號(hào)。

2.3 番木瓜胚性愈傷組織浸泡轉(zhuǎn)化法

2.3.1 不同因素對(duì)番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的效果在組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，番木瓜愈傷組織普遍存在內(nèi)生菌污染現(xiàn)象，而CⅡb型松散型愈傷的內(nèi)生菌則相對(duì)較少，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的除菌效果也較徹底。極差分析結(jié)果表明。4種因素促進(jìn)CⅡb型胚性愈傷組織體胚發(fā)生的作用大小為AS濃度>共培養(yǎng)天數(shù)>菌液光密度值>侵染時(shí)間，適中的AS濃度(100μmol·L^-1)、延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間、較高濃度的菌液光密度值、以及縮短侵染時(shí)間都有助于提高體CⅡb型愈傷體胚發(fā)生能力。這些形成的體胚隨著選擇培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，同樣逐漸白化死亡，最終只有個(gè)別體胚得以存活。進(jìn)一步分析不同因素間對(duì)轉(zhuǎn)化效率作用的大小，結(jié)果表明。AS濃度>共培養(yǎng)天數(shù)=菌液光密度值：侵染時(shí)間，理論上最佳的轉(zhuǎn)化法組合為：100μmol·L^-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培養(yǎng)2d。最終，通過(guò)統(tǒng)計(jì)共轉(zhuǎn)化效率，得出各因素對(duì)提高共轉(zhuǎn)化效率的作用大小一致。理論上最佳的共轉(zhuǎn)化組合為：100μmol·L^-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培養(yǎng)3d，即在最佳轉(zhuǎn)化組合的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間，有助于提高共轉(zhuǎn)化的效率。與前種轉(zhuǎn)化方法相比。該法對(duì)番木瓜胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率略有提高，但仍較低。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的再生與分子檢測(cè) 對(duì)經(jīng)浸泡轉(zhuǎn)化法所獲得的3個(gè)具Kan抗性的體胚轉(zhuǎn)移至不含Kan的增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)體胚萌發(fā)和植株再生。收集再生植株葉片提取DNA，分別進(jìn)行GUS基因和RNAi-β-Gal／結(jié)構(gòu)的PCR檢測(cè)。3株再生植株的基因組中，1株為雙T-DNA共轉(zhuǎn)化植株，1株只含外源GUS基因，1株則為假陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株(圖7)。

2.4 轉(zhuǎn)基因番木瓜的生根誘導(dǎo)與移栽

觀察發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化植株在含有Kan的生根培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)生長(zhǎng)周期，仍難以生根。并有玻璃化的趨勢(shì)。因此將其轉(zhuǎn)接至不含Kan的生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，采用兩步法誘導(dǎo)生根。轉(zhuǎn)移至無(wú)激素的1／2MS培養(yǎng)基后50d左右，在莖段基部誘導(dǎo)出了若干條細(xì)長(zhǎng)且具根毛的肉質(zhì)根，但同時(shí)形成了一團(tuán)愈傷組織(圖版C)。經(jīng)煉苗后，將轉(zhuǎn)基因植株移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中(圖版D)。

3 討論

番木瓜果實(shí)采后貯藏和運(yùn)輸期間，以及加工過(guò)程中的快速軟化與腐敗變質(zhì)，是制約番木瓜商品化生產(chǎn)的一個(gè)主要原因。我們以一條番木瓜果實(shí)后熟軟化過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞壁水解酶基因β-Gal作為沉默的靶基因，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)舊取代傳統(tǒng)的反義技術(shù)，開(kāi)展番木瓜采后轉(zhuǎn)基因育種的研究。目前，該技術(shù)在番木瓜抗病育種上已顯示出較好的應(yīng)用前景。魏軍亞等利用我國(guó)番木瓜主產(chǎn)區(qū)環(huán)斑病毒外殼蛋白(PRSV-CP)基因同源區(qū)段構(gòu)建了RNAi植物表達(dá)載體，進(jìn)行了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番木瓜抗病毒試驗(yàn)。經(jīng)菌液注射番木瓜幼苗葉片，在接種PRSV病毒10～14后葉片未表現(xiàn)任何癥狀，未經(jīng)注射的對(duì)照則表現(xiàn)出典型的花葉癥狀。表明，RNAi技術(shù)具有高效沉默同源目的基因的功能，是本研究繼續(xù)選育性狀穩(wěn)定的抗軟化轉(zhuǎn)基因番木瓜的重要因素。

隨著當(dāng)今轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因番木瓜已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性問(wèn)題的關(guān)注程度日漸升高，包括選擇標(biāo)記基因是否有毒或者會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，以及選擇標(biāo)記基因的水平和垂直轉(zhuǎn)移所帶來(lái)的醫(yī)用安全和環(huán)境生態(tài)問(wèn)題。在這樣的形勢(shì)下。無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，有助于提高人民大眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的接受程度。本研究在番木瓜上首次嘗試共轉(zhuǎn)化雙T-DNA／單質(zhì)粒系統(tǒng)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番木瓜胚性愈傷組織，并誘導(dǎo)體胚發(fā)生和植株再生，初步獲得了分子檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因番木瓜。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，植物表達(dá)載體p2301／TTRG上的兩段T-DNA區(qū)段將發(fā)生獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，從而有望從抗性體胚再生植株中獲得選擇標(biāo)記基因與外源基因不連鎖的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株的一次有性雜交便可使兩者發(fā)生分離，剔除選擇標(biāo)記基因(nptⅡ)，選育只含外源基因(RNAi-β-Gal)的無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因番木瓜，為今后選育無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因番木瓜奠定了工作基礎(chǔ)。

然而，與單T-DNA轉(zhuǎn)化相比，雙T-DNA共轉(zhuǎn)化進(jìn)一步增加了轉(zhuǎn)化的難度，同時(shí)轉(zhuǎn)化植株中還存在單T-DNA轉(zhuǎn)化的干擾，最終導(dǎo)致較低的共轉(zhuǎn)化效率。相比本研究中的2種轉(zhuǎn)化方式，浸泡法的效率略高于液體振蕩轉(zhuǎn)化法。經(jīng)正交分析，該法中與外植體的轉(zhuǎn)化效率和死亡率關(guān)系最為密切的因素是AS。因此，如何提高番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌的活性，并配合最佳的外植體和遺傳轉(zhuǎn)化方式，以提高番木瓜的共轉(zhuǎn)化效率，將是我們后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。本文針對(duì)番木瓜果實(shí)貨架壽命短的特點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)和雙T-DNA植物表達(dá)載體，優(yōu)化番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因番木瓜。以期后續(xù)進(jìn)一步選育無(wú)抗標(biāo)記的番木瓜株系，為培育對(duì)生態(tài)和人體安全的轉(zhuǎn)基因食品提供借鑒。