柑橘黃酮對內毒素誘發大鼠乳腺炎的抑制作用*

徐曉虹， 陸 蓓,2， 阮 琴

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004;2.金華市藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

柑橘為蕓香科柑橘屬植物，其干燥果皮可用作中藥材陳皮，有理氣健脾、燥濕化痰的功效，是我國常用中藥資源之一.藥理學研究表明黃酮是柑橘皮中的有效活性成分，具有抗炎[1]、抗氧化[2-3]、抗過敏[4]及降低血液和肝臟中膽固醇的作用[5].柑橘黃酮(citrus flavonoids，Cf)的主要成分之一橙皮苷(hesperidin)屬二氫黃酮苷化合物，是制備二氫黃酮類和二氫查爾酮等藥物的原料，具有防治心腦血管疾病和支氣管炎的作用.此外，早在《本草綱目》中就有陳皮甘草湯治療乳癰的記載.乳癰即現代醫學的急性乳腺炎，其成因與肝氣郁結、胃熱壅滯有關.大劑量的陳皮可理氣開瘀，結合辨證加味，對未成膿的急性乳腺炎初期有很好的防止化膿、消退癰腫作用.但目前國內外有關柑橘黃酮抗乳腺炎的研究未見報道.

乳腺炎是奶牛養殖中最常見且治療費用高的一種疾病，給奶牛業帶來極大的損失.長期以來，國內外主要應用抗生素和抗菌藥物治療奶牛乳腺炎，雖然效果較好，但可導致動物的抗藥性，并造成抗生素在牛奶中殘留，長期飲用有害人體健康.柑橘的世界年產量居水果首位，我國柑橘產量居世界第一，每年大量加工和消費柑橘的同時也產生數量驚人的柑橘果皮(約占果質量的20%～25%).如果柑橘黃酮具有抑制乳腺炎的作用，那么，既可以利用柑橘果皮提取其有效成分用于臨床防治乳腺炎，又可開發奶牛飼料添加劑用以防治奶牛乳腺炎的發生.為此,本實驗用大腸桿菌內毒素誘發大鼠乳腺炎模型，研究了柑橘黃酮抗乳腺炎的作用，并進一步測定了其對乳腺炎主要病原菌的體外抑菌活性.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品

柑橘黃酮(Cf)由金華貝康公司提供，含橙皮苷5.72%，總黃酮12.30%;內毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由O55：B5血清型大腸桿菌(Escherichiacoli)分離提純(購自美國Sigma公司);加拿大樹膠(20010621)從加拿大進口;其余試劑均為國產分析純.與BECKMAN LX20全自動生化測定儀(美國貝克曼庫爾特公司)相配套的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)測定試劑盒.

1.2 菌種及培養基

大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusauerus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)均由中國藥品生物制品檢定所提供.所用培養基均為干燥培養基，由北京三藥科技開發公司提供.

1.3 動物分組及處理

SD大鼠，雌性24只，體質量250～280 g；雄性12只，體質量300～350 g，從浙江省實驗動物中心購入，合格證號SCXK(浙)2003-0001.適應性飼養1星期后，將雌鼠與雄鼠按2∶1比例合籠飼養，使之交配受孕.次日08:00時檢查陰栓并對雌性大鼠陰道進行涂片檢查精子，凡查到精子的定為妊娠第0天.將妊娠大鼠隨機分為4組，自確認妊娠當日開始灌胃給藥,正常對照組(n=6)和模型組(n=6)給予生理鹽水，高、低2個劑量實驗組(H-Cf,n=6;L-Cf,n=6)分別給予600和200 mg·kg-1·d-1柑橘黃酮.給藥時間自妊娠第1天直至處死(產后4 d).模型組及實驗組分別于產后72 h經乳頭管注入內毒素0.01 mL(10 μg),正常對照組于產后72 h經乳頭管注入滅菌生理鹽水0.01 mL.

1.4 乳腺炎模型的建立

按文獻[6]的方法經乳頭管灌注大腸桿菌內毒素誘發大鼠急性乳腺炎動物模型.乳腺內灌注前24 h將母鼠與仔鼠分離.母鼠在產后72 h經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用75%乙醇溶液對第4對乳腺區域(腹部乳區)進行消毒，然后用小鑷子輕輕夾起乳頭，用20 μL的微量注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，注入10 μg(0.01 mL)內毒素.灌注后24 h，將母鼠頸靜脈放血處死.

1.5 血清堿性磷酸酶(AKP)的含量測定

放血處死母鼠時收集頸靜脈血，室溫放置20 min后，3 000 r/min離心15 min分離血清，用AKP試劑盒測定AKP水平.

1.6 乳腺病理學觀測

母鼠頸靜脈放血處死后，打開腹腔，觀察乳腺的病理變化.分離第4對乳腺，取適量乳腺組織用10%甲醛溶液固定，制備石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色處理后用于病理學檢查.

1.7 最低抑菌濃度(MIC)測定

為了進一步分析對柑橘黃酮敏感的主要乳腺炎致病菌，采用試管稀釋法(二倍稀釋法)測定柑橘黃酮對3種乳腺病原菌的最低抑菌濃度[7].取37 ℃培養18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌株的營養肉湯培養物，用9 g/L滅菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，使最終菌液濃度為1×103～1×105cfu·mL-1.柑橘黃酮用滅菌生理鹽水溶解后制成0.1 g·mL-1的母液，采用集菌儀與一次性薄膜過濾器除菌.用試管稀釋法測定MIC時，每種菌液分5管分別加入含0.05,0.025,0.012 5和0.006 g·mL-1柑橘黃酮和滅菌生理鹽水(空白對照)的培養液，每一濃度重復3管.細菌經37 ℃培養48 h，真菌經25 ℃培養72 h后，分別觀察結果，得出柑橘黃酮對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度.

1.8 數據統計方法

2 結 果

2.1 乳腺病理變化的組織學檢查

乳腺內灌注內毒素24 h后，各組母鼠均無死亡.從圖1病理切片結果可見:灌注滅菌生理鹽水的對照組大鼠乳腺組織無異常病理變化(見圖1中A和B)；乳腺內灌注內毒素24 h后，大鼠乳腺組織結構崩塌，腺體內有大量密集炎性細胞浸潤，其中以嗜中性粒細胞為主(見圖1中C和D);低劑量柑橘黃酮預處理的母鼠乳腺灌注內毒素24 h后乳腺組織結構不清，但仍可辨認，腺泡腔內出現炎性細胞浸潤，以嗜中性粒細胞為主(未顯示病理圖片);高劑量柑橘黃酮預處理的母鼠灌注內毒素24 h后乳腺組織結構清楚，腺泡腔內空泡數量增加，只有少量的炎性細胞浸潤(見圖1中E和F).

對照組乳腺組織:A(×100),B(×400);模型組乳腺組織:C(×100),D(×400);600 mg·kg-1·d-1柑橘黃酮組乳腺組織:E(×100),F(×400)

2.2 血清堿性磷酸酶(AKP)含量測定

與對照組相比，模型組的AKP含量明顯升高(P<0.01)；而高劑量柑橘黃酮組母鼠的AKP水平極顯著低于模型組(P<0.01)，低劑量柑橘黃酮組的AKP水平與模型組相近，并明顯高于對照組(P<0.01,見表1).

2.3 最低抑菌濃度(MIC)測定

柑橘黃酮對3種乳腺病原菌均有抑制作用，但不同菌種對柑橘黃酮的敏感性不同.柑橘黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC為0.012 5 g·mL-1，對大腸埃希氏菌及銅綠假單胞菌的MIC為0.025 g·mL-1(見表2).

表1 柑橘黃酮對母鼠血清中堿性磷酸酶含量的影響

表2 柑橘黃酮水溶液的抑菌作用

3 討 論

本實驗采用從乳頭管注入內毒素誘導分娩3 d的母鼠發生乳腺炎.大腸桿菌內毒素是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成成分，是介導系統性炎癥反應綜合癥的主要啟動因子.內毒素本身并不造成機體的嚴重損害，它主要促使巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞等釋放大量的細胞因子TNF,PLA2,PKC,IL-6,前列腺素和氧自由基等，這些因子通過自分泌、旁分泌相互聯系、相互影響，使病變得以發展[8].嗜中性粒細胞是乳腺炎癥早期的主要浸潤細胞，而在健康乳腺中嗜中性粒細胞的數量很低(<105/mL).發生乳腺炎時，嗜中性粒細胞在炎性介質的誘導下從血液向乳腺游走，其數量可占整個乳腺白細胞的90%以上(>106/mL)[9].從本實驗的病理切片可見,乳腺炎模型的乳腺泡腔內出現大量以嗜中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，與文獻報道的乳腺炎病理變化相一致，說明內毒素誘發大鼠乳腺炎模型成立.

母鼠妊娠后每天給予柑橘黃酮可以有效減輕內毒素誘導的乳腺炎的發生，特別是高劑量(600 mg·kg-1·d-1)的柑橘黃酮具有明顯的抑制乳腺炎癥反應的作用.有報道:柑橘黃酮類化合物中的橙皮苷是一種有效的抗過敏成分，能顯著抑制小鼠的巨噬細胞釋放組胺；橙皮苷和洋芫荽苷可抑制脂氧合酶、環氧化酶和磷酸脂酶A2，從而顯著抑制膜溶酶體和花生四烯酸的釋放；而花生四烯酸釋放的抑制又促使脂氧合酶、環氧化酶的底物缺乏，進一步抑制在炎癥中起關鍵作用的組胺的釋放，從而起到抗炎和抗過敏作用[10].同時，柑橘黃酮還可影響與炎癥相關的淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜堿性細胞、中性粒細胞的分泌、移動,促進有絲分裂等活動[11-12].因此，柑橘黃酮預防大腸桿菌內毒素誘導的乳腺炎發生可能與其抑制乳腺細胞的炎癥反應有關.

堿性磷酸酶在生理性pH環境下能有效地將內毒素(脂多糖)的類脂A去磷酸化，削減脂多糖的生物活性，抑制內毒素誘發炎性細胞因子的產生,從而達到解毒作用，并阻止內毒素性休克的發生與發展[13].本實驗發現乳腺炎模型大鼠血清的堿性磷酸酶活性比對照組顯著升高.這可能與內毒素灌注后誘發體內堿性磷酸酶的激活，以削弱內毒素的生物活性，減少其誘導炎性細胞因子的產生有關.這就不難解釋高劑量柑橘黃酮組大鼠的血清堿性磷酸酶水平明顯低于乳腺炎模型組的現象：在內毒素誘導乳腺發炎的初始階段,柑橘黃酮就抑制了組胺及炎性細胞因子的釋放，減輕炎性反應，因而體內誘發的堿性磷酸酶減少.

乳腺炎的發病原因有多種，但主要由病原微生物引起.而誘發乳腺炎的病原菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌，奶牛的乳腺炎還可由無乳鏈球菌和停乳鏈球菌等引起[14].真菌性乳腺炎主要由念珠菌屬、隱球菌屬、毛孢子菌屬和曲霉菌屬等引起, 但不多見[15].因此,本研究對主要的3種乳腺炎病原菌進行了柑橘黃酮的抑菌實驗,結果顯示柑橘黃酮具有一定的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的抑制作用次之.對于奶牛乳腺炎的發生，有研究發現金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌逐漸代替鏈球菌已成為引起奶牛乳腺炎的最重要致病菌，而干奶期乳腺炎病原菌以大腸桿菌為主[16].本研究結果表明柑橘黃酮對引起乳腺炎的主要病原菌金黃色葡萄球菌及大腸桿菌有顯著的抑制作用.黃酮類化合物的化學結構屬于酚類衍生物，柑橘黃酮的抑菌作用可能與其含有酚羥基苯環有關[17].酚類物質可通過破壞病原菌細胞壁和細胞膜的完整性，使微生物細胞釋放胞內成分，導致膜的電子傳遞、營養吸收、核苷酸合成及三磷酸腺苷(ATP)活性等功能發生障礙，從而抑制微生物的生長.

綜上所述，柑橘黃酮可預防乳腺炎的發生，該作用可能與其抑制細胞炎性反應的發生和對乳腺炎病原菌的抑制作用有關.雖然柑橘黃酮中總黃酮的含量較低(僅為12.3%)，但抑菌活性較強.由于柑橘果皮中含有豐富的柑橘黃酮，因此，柑橘黃酮有望作為奶牛的飼料添加劑以代替抗生素用于預防奶牛乳腺炎的發生.

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