北細辛內生真菌的分離鑒定及代謝產物的生物活性

包麗霞,殷 瑜,楊 天,楊和行,錢秀萍＊

(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海來益生物藥物研發中心,上海 201203)

細辛為馬兜鈴科細辛屬藥用植物,應用歷史悠久,功效顯著,史載于《神農本草》?！吨袊幍洹?2005年版)將北細辛(Asarum heterotropoides var.Mandsh uricum(Maxim.)Kitag.)、漢城細辛(Asarum sieboldiivar.seoulense Nakai.)和華細辛(Asarum sieboldii)列為正品,北細辛列正品之首[1]。北細辛為北方主要道地中草藥,藥用成分為揮發油,全草入藥,具有發表散寒、溫肺祛痰的功效[2]。體外試驗證明,細辛浸膏對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、痢疾桿菌及傷寒桿菌有抑制作用,其煎劑對結核桿菌、傷寒桿菌有抑制作用[3]。植物內生菌具有生物多樣性的特點,不僅能夠參與植物次生代謝產物的合成以及對植物次生代謝產物進行轉化,還能獨立產生豐富的次生代謝產物,是天然產物的重要來源和具有高度開發價值的新型生物資源。近十年來植物內生菌及其活性代謝產物成為微生物學研究的一大熱點[4-6]。從北細辛中分離植物內生真菌,以及對其內生真菌代謝產物進行活性研究的報道至今未見。文中對3株川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛進行了內生真菌的分離和鑒定,并檢測其代謝產物對肺癌細胞、乳腺癌細胞和胰腺癌細胞的抑制作用,以及靶向抑制脂肪酸合成的抗菌活性,旨在為開辟抗菌抗腫瘤藥物新途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 北細辛(Asarum heterotropoides var.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.) 川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛于2009年8月采自四川、陜西,由上海交通大學藥學院劉忠副教授鑒定。

1.1.2 腫瘤細胞株 A549(肺癌細胞);MDAMB-231(乳腺癌細胞);PANC-1(胰腺癌細胞),由上海來益生物藥物研發中心保藏。

1.1.3 檢定菌株 E.coliTOP10/pHN678(對照菌株);E.coliTOP10/pHNA(酰基載體蛋白ACP特異性敏感工程菌);E.coliTOP10/pHNF(脂肪酸合成酶FabI特異性敏感工程菌)。由上海來益生物藥物研發中心保藏。

1.1.4 培養基 PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂);固體發酵培養基：大米4 g,水5 mL;LB培養基(Solarbio);F12K培養基(Sigma);RPM I培養基(Gibco);DMEM培養基(Gibco)。

1.1.5 主要試劑和儀器 Tris(Amersco),MTT(Amersco),胎牛血清(Hyclone),SDS、苯酚-氯仿、RNAse、dNTP、熱穩定DNA聚合酶、IPTG、Amp、戊基泛酸、三氯生、通用引物ITS1和ITS4(上海生工生物),其他試劑均為化學純;PCR儀(Eppendorf),MK-2全自動酶標儀(Thermo),CO2培養箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離[7]將3株新鮮的北細辛沖洗干凈,除去泥土等大顆粒,用95%乙醇浸泡1 min,無菌水沖洗2次后用9%次氯酸鈉浸泡5 min。再用無菌水沖洗3次后用95%乙醇浸泡30 s,然后用無菌水沖洗3次。將上述處理好的樣品切成0.5 cm長的小塊置于含氯霉素(80 U/mL)的PDA平板,每個平板放置6～8塊,28℃恒溫靜置培養,3～5 d后,培養基上長出菌絲,挑取菌絲于PDA平板,經純化后得到表觀形態不一的內生真菌。表面消毒最后1次沖洗后的無菌水,取少量涂布于含氯霉素(80 U/mL)的PDA平板,28℃恒溫培養,觀察是否有真菌長出。

1.2.2 真菌總DNA的提取 將純化菌株的孢子和菌絲接入PDA培養基,28℃培養3 d后獲得菌體。在2 mL離心管內裝入400μL的玻璃珠(Ф=0.5 mm),1×105Pa滅菌20 min,在離心管內加入400～500μL TE(pH 8.0)緩沖液和40μL 10%SDS,然后加入少量菌絲,振蕩4 min,10 000 r/min離心8 min;取上清,加入等量(約400μL)苯酚-氯仿,振搖數次,12 000 r/min離心3 min;取上清,加入等量氯仿,振搖數次,12 000 r/min離心3 min;取上清,加入等量異丙醇,混勻,12 000 r/min離心5 min;棄上清,加入500μL 70%乙醇,12 000 r/min離心5 min,重復2次;加入30～40 μL含RNAse TE緩沖液,37℃水浴30 min。

1.2.3 PCR擴增 利用真菌18S rDNA內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,反向)擴增純化菌株的r DNA的ITS區[8]。反應體系(50 μL)：超純水35.75μL,10×擴增緩沖液5μL,25 mmol/L MgCl22μL,2.5 mmol/L dNTP 2μL,10 μmol/L ITS1引物2μL,10μmol/L ITS4引物2 μL,10 U/L熱穩定DNA聚合酶0.25μL,模板DNA 1μL。反應條件：94℃預變性5 min,94℃變性1 min,55℃復性30 s,72℃延伸1 min,共30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物由上海美季生物技術有限公司測序。

1.2.4 序列分析 將獲得的序列通過Blast程序在GenBank上進行相似性序列檢索,將其序列連同其近似序列導入MEGA version 4.1中進行比對,利用鄰位互換算法(CN I)搜索最小進化樹(ME tree),并進行500次重復的自展檢驗(boot-strap),將ME樹上與之最接近的種類確定為分離菌株可能的種類,并參照文獻[9]進行分類歸屬。1.2.5 內生真菌發酵產物制備 將純化內生真菌菌株接種于大米固體發酵培養基中,28℃恒溫靜置培養30 d后,用甲醇◇丙酮◇丁酮=1◇3◇1浸泡培養物4 h。3 500 r/min離心5 min后,上清液待測。

1.2.6 抗腫瘤活性檢測 腫瘤細胞A549采用F12K培養基,MDA-MB-231采用RPM I培養基,PANC-1采用DMEM培養基進行培養。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(3-(4,5-dimethy-2-thiazoly)-2,5-diphenyl-2H-tetyazoliumbromide,MTT)檢測樣品的抗腫瘤活性[10]。

1.2.7 體外抑菌活性檢測[11]以E.coli TOP10/pHN678為對照菌株,ACP和FabI抑制劑高度敏感的E.coliTOP10/pHNA和E.coli TOP10/pHNF為檢定菌株測定抗菌活性。將E.coliTOP10/pHN678、E.coliTOP10/pHNA和E.coliTOP10/pHNF接種于LB液體培養基37℃培養過夜,分別加至反應液(20 mL LB液+7.5μL IPTG)中,使菌濃為OD600nm=0.1、IPTG終濃度為37.5μmol/L,標記為678液、HNA液和HNF液。取96孔板分別加入100μL含對照菌和檢定菌的678液、HNA液和HNF液,再分別加入5μL待測樣品。E.coliTOP10/pHN678對照菌株組設Amp陰性對照、戊基泛酸陽性對照和三氯生陽性對照;E.coliTOP10/pHNA和E.coliTOP10/pHNF分別設Amp陰性對照和戊基泛酸陽性對照,及Amp陰性對照和三氯生陽性對照。37℃80 r/min過夜培養,用酶標儀測定OD600nm值。按下列算式計算抑制率：

2 結果與討論

2.1 北細辛優勢內生真菌的分離

高濃度殺菌劑短時間處理比低濃度殺菌劑長時間處理更適合植物內生真菌的分離[12]。本實驗表面消毒法采用高濃度次氯酸鈉(9%)浸泡5 min,最后一次洗滌的無菌水在PDA培養基上沒有長菌,說明表面消毒較徹底,分離到的內生真菌確是北細辛的內生真菌,而不是表面的附生菌。川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛為北細辛的3個不同種,本實驗中分離到川北細辛優勢內生真菌6株,四川北細辛和陜西北細辛的優勢內生真菌分別為2株。這10株內生真菌的形態特征不同(表1),表明植物生長地區和品種不同,其優勢內生真菌的種類和數量也不相同,其中川北細辛的內生真菌生物多樣性較為豐富。本實驗相對分離到較少內生菌,其原因可能是：①3株北細辛僅生長1～2片真葉,生長年限較短,按植物內生真菌侵入的起源學說[13],內生真菌較少;②在PDA培養基上優勢菌株生長很快,搶奪了弱勢菌株的營養;③有很多內生真菌(尤其是專性寄生內生真菌)即便用不同的培養基進行分離,也不能在人工培養基上生長[14];④分離時只挑取了表觀形態不同的真菌進行培養,導致表觀形態相同但可能種屬不同的內生真菌的遺漏。

表1 北細辛優勢內生真菌的形態特征Table 1 Morphological characteristics of predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

2.2 北細辛優勢內生真菌的鑒定

經PCR擴增和ITS序列測序,10株北細辛優勢內生真菌的ITS序列與GenBank登錄的17株真菌的相似性在97%以上(表2)。序列結果在NCB I上Blast比對后,構建的系統發育樹見圖1。根據親緣關系的遠近,再參照文獻[9]對內生真菌進行分類歸屬。10株內生真菌分屬于子囊菌門(Ascomycota)和半知菌類(Fungi Imperfecti)的3個綱4個目5個科5個屬,如表3所示。北細辛內生真菌中以柄孢殼菌屬(Podospora)最多,小叢殼屬(Glom erella)和鐮孢屬(Fusarium)次之。

表2 優勢內生真菌ITS序列相似性分析Table 2 Similarity of the ITS sequence from the predominant endophytic fungi

圖1 根據ITS序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree on the basis of ITS sequences

表3 北細辛優勢內生真菌的組成Table 3 Predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

在3株不同來源的北細辛中分離到的優勢菌株種類和數量也存在差異,如表4所示。川北細辛中的優勢菌株種類和數量最多,而陜西北細辛的優勢內生真菌種類僅一種且不同于其余2種北細辛的內生菌。

表4 北細辛優勢內生真菌的分類Table 4 Genus of predominant endophytic fungi fromAsarum heterotropoides

2.3 北細辛優勢內生真菌代謝產物的抗腫瘤活性

表5 北細辛優勢內生真菌的抗腫瘤活性Table 5 Antitumor activities of predominant endophytic fungi fromAsarum heterotropoides

檢測10株內生真菌代謝產物抗肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和胰腺癌細胞(PANC-1)的活性,結果如表5所示。菌株E1、E5、E8和E9對A549、MDA-MB-231或PANC-1細胞各有不同程度的抑制活性,其中從陜西北細辛中分離的鐮孢屬(Fusariumsp.)菌株E9的抗腫瘤活性最高,對3種腫瘤細胞均有超過75%的抑制率。

2.4 北細辛優勢內生真菌的抗菌活性

表6 北細辛優勢內生真菌的抗菌活性Table 6 Antibacterial activities of predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

脂肪酸合成對細菌的存活至關重要。脂肪酸合成酶(FAS)系統的亞基蛋白已成為基因組驅動的新型抗菌藥物靶標研究的熱點。?；d體蛋白(ACP)和NADH依賴的烯?；?ACP還原酶(FabI)是催化脂肪酸合成的主要功能酶,廣泛存在于細菌中,在細菌脂肪酸生物合成中起著必要的調節作用[15]。通過抑制ACP和FabI活性,可抑制脂肪酸的生物合成而致細菌死亡。

本實驗以E.coliTOP10/pHNA(?；d體蛋白ACP特異性敏感工程菌)和E.coliTOP10/pHNF(脂肪酸合成酶FabI特異性敏感工程菌)為生物檢定菌,檢測10株內生真菌代謝產物對靶點ACP或FabI的抑制活性,結果見表6。刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)菌株E6和小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E7僅有針對FabI靶點的抗菌活性。小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E1和葉點霉屬(Phyllostictasp.)菌株E2具有靶向ACP和FabI的抗菌活性,且抗FabI的活性較強,抑制率達59%。

3 結 論

內生真菌存在于目前所有已研究的植物中。細辛生長緩慢,通常從播種到開花結果需5～6 a[3],這給細辛有效成分的開發利用帶來很大困難。而許多植物內生菌在長期的自然選擇下能夠產生與寄主植物相同或相似的具生物活性的次級代謝產物,這為發現新的先導化合物、開發新藥及保護瀕危植物提供了重要的開發和利用途徑[16]。

本文對3株不同來源的北細辛優勢內生真菌進行了分離鑒定,各自分離到的優勢菌株種類和數量各不相同,表明不同種類和生長地區的北細辛其優勢內生真菌的種類和數量存在差異。對北細辛中分離到的10株優勢內生真菌進行了靶向脂肪酸合成的抗菌活性以及抗腫瘤活性篩選,獲得3株活性較高的菌株小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E1、葉點霉屬(Phyllostictasp.)菌株E2和鐮孢菌(Fusariumsp.)菌株E9,具有一定的潛在應用價值,有可能會為抗腫瘤抗菌新藥的研究開發利用提供一條新的途徑。今后將進一步確定這些菌株發酵液中抗腫瘤抗菌活性物質的組分及相應的化學結構,探明這些內生真菌是否產生與宿主北細辛相同或相似的抗腫瘤抗菌成分或是產生了新的活性物質,并評價其應用前景。

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