礬冰納米乳對臨床常見病原菌體外抗菌活性的研究

劉麗芳,張陽德,伍參榮

(1.中南大學肝膽腸外科研究中心,湖南長沙 410008;2.湖南中醫藥大學附屬第一醫院,湖南長沙 410007;3.湖南中醫藥大學,湖南長沙 410208)

白礬、冰片系常用中藥,臨床應用廣泛,歷史悠久。以白礬、冰片制備的礬冰液,在燒傷、皮膚病、靜脈炎、外科創面感染等疾病的治療方面取得了一定的療效。但礬冰液為淡黃色混懸液,是一種分散不均勻的給藥系統,其中冰片水溶度差,易結晶析出,故生物利用度較低。納米乳作為藥物載體具有顯著提高藥物水溶性、分散性好、有利于機體吸收等優點。本研究制備了白礬與冰片的O/W型復合納米乳,檢測了該納米乳體外抗菌活性并與傳統礬冰液進行了比較,以期為礬冰納米乳的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從臨床標本中分離的12株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、10株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epider m idis)、12株大腸埃希菌(Escherichia coli)、8株銅綠假單胞菌(Pseudom onas aeruginosa)、11株白假絲酵母菌(M onilia albicans)由湖南中醫藥大學病原與免疫臨床教研室和湖南中醫藥大學第一附屬醫院細菌檢測中心分離、鑒定并提供;金黃色葡萄球菌ATCC25923株、大腸埃希菌ATCC25922株、銅綠假單胞菌ATCC27853株、白假絲酵母菌ATCC10231株由湖南中醫藥大學微生物室提供。1.1.2 培養基 營養肉湯(瓊脂)培養基(杭州四季青生物試劑股份有限公司,批號2009010702)用于細菌培養;含氯霉素沙保液體(瓊脂)培養基(廣東環凱微生物科技有限公司生產,批號200909203)用于白假絲酵母菌培養。

1.1.3 藥物 礬冰納米乳由湖南中醫藥大學863課題組提供,規格16.3 mg/mL,批號20090610;礬冰液由湖南中醫大學附屬第一醫院制劑室生產,規格16.3 mg/mL,批號20090317;燙瘡油由湖南邵陽華仁堂藥業發展有限公司生產,規格30 mL/瓶,批號090103;注射用頭孢氨芐粉針劑由哈藥集團第三制藥廠生產,規格1 g/瓶,批號20091001003,實驗時用滅菌蒸餾水配成5μg/mL頭孢氨芐溶液,作為抗革蘭陽性菌藥物對照;乳酸左氧氟沙星注射液由武漢神康醫藥有限公司生產,規格0.2 g/100 mL,批號2010022321,實驗時用滅菌蒸餾水稀釋成20μg/mL,作為抗革蘭陽性及革蘭陰性菌藥物對照;氟康唑由濟南中科一通化有限公司生產,規格100 mg/50 mL,批號20091062302,實驗時用無菌蒸餾水配成2μg/mL氟康唑溶液,作為抗白假絲酵母菌藥物對照。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂擴散法 營養肉湯瓊脂或沙保瓊脂高壓滅菌后室溫中冷卻至50℃左右,分別取15 mL傾注于直徑10 cm滅菌平皿中,待瓊脂凝固后37℃培養24 h進行無菌檢查。取上述各菌株對數生長期菌液配制成1×105cfu/mL的懸液,各取100μL均勻涂布接種于檢菌合格的瓊脂平板上。用6 mm打孔器在平板上打孔,每平板4孔,然后分別加入試驗藥礬冰納米乳及對照藥礬冰液、燙瘡油、頭孢氨芐、乳酸左氧氟沙星、氟康唑各300 μL/孔,37℃培養24 h后用游標卡尺測定各藥物抑菌圈直徑并進行比較。

1.2.2 M I C測定 采用2倍試管稀釋法。在滅菌試管中每管分別加入營養肉湯或沙保液體培養基1.0 mL,對試驗藥礬冰納米乳、對照藥礬冰液進行連續2倍稀釋,稀釋度1◇2～1◇32,使礬冰納米乳和礬冰液質量濃度分別為4.08、2.04、1.02、0.51和0.26 mg/mL,分別加入1×105cfu/mL各菌懸液0.1 mL/管,37℃培養24 h觀察各藥物最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,M I C)。以50%和90%同種細菌菌株未見生長的藥物最高稀釋度為M IC50和M IC90。實驗中同時設置加藥不加菌的藥物對照、加菌不加藥的菌株對照及不加藥不加菌的培養基對照。

1.2.3 殺菌試驗 取5 mL礬冰納米乳、礬冰液原液分別加入1×106cfu/mL各細菌懸液或1×105cfu/mL白假絲酵母菌懸液500μL,37℃水浴分別孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3和4 h后各取100 μL置滅菌平皿中,傾注15 mL加熱溶解冷卻至50℃左右的營養肉湯瓊脂或沙保瓊脂,37℃培養24 h,用麥氏計數法計數細菌數并計算4 h內減少菌數的對數值。

2 結果與分析

2.1 礬冰納米乳對各菌株的抑制作用

瓊脂擴散法實驗結果證實,同一菌種對不同藥物的敏感性有差異(P＜0.05,F檢驗);礬冰納米乳與礬冰液對臨床菌株和標準菌株均有一定的抗菌作用,但礬冰納米乳強于礬冰液(P＜0.05,F檢驗)(圖1、表1和表2)。

表1 受試藥物對臨床菌株抑菌效果比較(ˉχ±s,n=9)Table 1 Comparison of inhibitory effects of the tested drugs against clinical strains

表2 受試藥物對標準菌株抑菌效果比較(ˉχ±s,n=9)Table 2 Comparison of inhibitory effects of the tested drugs against standard strains

圖1 受試藥物對不同菌株的抑菌圈Fig.1 Inhibitory rings of the tested drugs against different strains

2.2 M I C測定結果

礬冰納米乳對臨床分離的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌M I C90值分別為1.02、2.04和2.04 mg/mL,均低于礬冰液的M I C90值(P＜0.05,t檢驗);礬冰納米乳對臨床分離的表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌的M IC90與礬冰液相同,均為1.02 mg/mL(P＞0.05,t檢驗)。見表3。

表3 礬冰納米乳與礬冰液M IC測定結果Table 3 Results ofM IC detection ofAlum-Borneol nanoemulsion and Alum-Borneol liquid

2.3 殺菌試驗結果

礬冰納米乳或礬冰液作用不同受試菌1 h后,均顯示有殺菌作用,但礬冰納米乳強于礬冰液(P＜0.05,方差分析);同一作用時間內礬冰納米乳對不同受試菌殺滅作用也強于礬冰液(P＜0.05,t檢驗)。見表4。

表4 礬冰納米乳與礬冰液殺菌作用Table 4 Bactericidal effects ofAlum-Borneol nanoemulsion and Alum-Borneol liquid

3 討 論

以白礬和冰片制備的外用中藥礬冰液具有清熱解毒、消腫止痛、生肌斂瘡作用[1],常用于皮膚感染、燒傷的臨床治療。有文獻報道,白礬有廣譜的抗菌作用,如對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌等細菌以及白色念珠菌等真菌均有明顯的抑制作用,冰片對多種細菌及真菌也呈現劑量依賴性抗菌活性[2-3]。然而,冰片水溶性較差而易于析出,嚴重影響其生物利用度,采用白礬與冰片的O/W型復合納米乳藥物劑型,可明顯改善冰片水溶性而提高藥效。

瓊脂擴散法實驗結果證實,礬冰納米乳對所有受試菌種的抑菌活性均明顯強于礬冰液(P＜0.05)(表1和表2);M I C測定試管法結果顯示表明,礬冰納米乳對臨床分離的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌M IC90值均低于礬冰液(P＜0.05),表明前者抑菌能力明顯強于后者;殺菌試驗結果表明,礬冰納米乳或礬冰液與金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌混合作用1 h后,活菌數均有所下降,但礬冰納米乳作用后活菌數下降程度明顯高于礬冰液(P＜0.05)(表4)。上述實驗結果提示,礬冰納米乳與礬冰液均有廣譜體外抑菌及殺菌活性,由于我們采用的礬冰納米乳和礬冰液中白礬及冰片劑量相同,表明將白礬及冰片復合物納米化可提高抗菌效果。

如前所述,礬冰納米乳體外抗菌作用明顯強于白礬及冰片含量相同的礬冰液,尤其對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌抗菌效果提升作用更為明顯,其原因可能有以下幾點：①礬冰納米乳提高了冰片的溶解度和生物利用度,使冰片的抗菌活性增強;②礬冰納米乳液滴粒徑小于50 nm,表面張力低,浸潤性、鋪張性好,更易于附著并滲入菌體內發揮抑菌或殺菌作用[4];③納米乳本身對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等細菌也有一定的損傷作用[5]。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌均為皮膚感染疾病、燒傷病人常見病原菌,我們的實驗證明礬冰納米乳體外抗菌效果明顯優于礬冰液,顯示了礬冰納米乳廣闊的臨床應用前景。

[1] 劉麗芳,周青,劉鴻賓.礬冰液濕敷治療淺Ⅱ°燒傷120例臨床觀察[J].中國中醫急癥,2002,11(6)：448.

[2] 黃曉敏,廖玲軍,曾松榮,等.梅花冰片3種劑型體外抗菌活性研究[J].江西中醫學院學報,2005,17(1)：63-65.

[3] 趙曉洋,蝎福,葛榮明,等.冰片抗真菌作用的超微結構觀察[J].哈爾濱醫科大學學報,1992,20(3)：295-297.

[4] 歐陽五慶,曹發昊,王艷萍.呋喃西林納米乳的制備及體外抑菌試驗[J].黑龍江畜牧獸醫雜志,2007,(6)：81-82.

[5] A I-Adham IS,Khalil E,A I-Hmoud ND,et al.Microemulsions are membrane active antimicrobial,self-preserving systems[J].J ApplMicrobiol,2000,89(1)：32-39.