高產生物表面活性劑菌株的紫外誘變選育

周理志,劉建勛,常澤亮,謝 英,杜國豐,趙 靜,梅曉丹＊

(1.中石油塔里木油田分公司新疆庫爾勒塔里木指揮部油氣工程研究院,新疆庫爾勒 841000;2.大連百奧泰科技有限公司研發中心,遼寧大連 116025)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 從新疆塔里木油田樣品中分離純化的產表面活性劑的菌株B IT-TLM1。

1.1.2 培養基(g/L) ①無機鹽培養基：NH4Cl 2.0,K2HPO41.5,KH2PO43.0,MgSO40.1,CaCl20.01,葡萄糖10,pH 7.5;②藍色凝膠培養基：牛肉膏1,葡萄糖20,蛋白胨5,酵母膏0.2,瓊脂18,十六烷基三甲基溴化銨0.2,亞甲基藍0.01。

1.2 方法

1.2.1 B IT-TLM1菌株生長曲線的測定 從平板上挑取B IT-TLM1菌株的單菌落,接種到無機鹽培養基中,40℃、150 r/min振蕩培養20 h,測定發酵液的表、界面張力,每隔2 h取4 mL發酵液在600 nm波長下測其OD值,繪制該菌的生長曲線。

1.2.2 紫外線誘變 取在40℃下振蕩(150 r/min)培養20 h的B IT-TLM1的培養液(OD600=1.580)進行梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,取100μL涂布于藍色凝膠平板[6],40℃靜置培養20 h,選取平板上菌落數為200～300個的稀釋濃度作為最佳的稀釋濃度。以最佳的稀釋濃度進行平板涂布后將培養皿置于與紫外燈(40 W)相距40 cm處分別照射10、20、30、40、50 s,照射之后立即將平板放置暗處避光2 h,另設未經紫外光照過的B IT-TLM1平板作為對照組,將對照組與試驗組平板均于40℃靜置培養20 h,觀察對照組與試驗組平板菌落數,試驗組再生菌落計數為B,對照組再生菌落計數為A,計算誘變致死率[7]：

1.2.3 誘變菌株的篩選 ①初篩：將菌株B ITTLM1紫外誘變后的再生菌落接種于藍色凝膠平板,40℃培養20 h,選取藍色凝膠平板藍色暈圈直徑比原始菌株B IT-TLM1大的菌株進一步復篩;②復篩：將初篩后的菌株接種于無機鹽培養基中,在40℃、150 r/min下振蕩培養20 h。將發酵液8 000 r/min離心20 min除去菌體,上清液用濃HCl調pH至2.0,出現絮狀沉淀,4℃靜置過夜,10 000 r/min離心30 min收集沉淀,用pH 2.0的酸溶液洗滌1次,將該沉淀溶于NaOH溶液,使最終pH值為7.0,干燥后得到淺褐色疏松狀固體的表面活性劑粗品。純化時,將粗品置二氯甲烷中抽提,旋轉蒸發后于稀NaOH溶液中溶解,形成多泡液體,濾紙過濾后,濾液再次加HCl調pH至2.0,將得到的沉淀離心,該沉淀物去除殘留水分后即為純品[8],稱重,計算發酵液中每克菌體表面活性劑的產量,與對照組相比,篩選出高產表面活性劑的誘變菌株。

1.2.4 誘變菌株遺傳穩定性測定 將篩選出的高產表面活性劑菌株在液體培養基中連續培養7代,于第1代、第4代、第7代測定其產表面活性劑的能力,考察誘變菌株產表面活性劑性能的穩定性。

1.2.5 碳源對誘變菌株產表面活性劑的影響在無機鹽培養基中分別添加1%的糖蜜、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、半乳糖、固體石蠟6種不同的碳源,在40℃、150 r/min條件下培養20 h,測定培養液中表面活性劑的產量,并以原始菌株B ITTLM1為對照,比較誘變前后菌株利用不同碳源產生物表面活性劑的能力[9]。

1.2.6 氮源對誘變菌株產表面活性劑的影響在無機鹽培養基中分別添加0.2%的蛋白胨、牛肉膏、尿素、KNO3、NH4Cl、NH4NO36種不同的氮源,在40℃、150 r/min條件下培養20 h,測定發酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B ITTLM1為對照,比較誘變前后菌株利用不同氮源產生物表面活性劑的能力[10]。

最后，在表6的各個模型中我引入了最后一個變量——公民性，該變量是本次研究中的一個創新，旨在探究公民的社會責任感與社會距離之間的關系。通過因子分析發現，在研究之初所選擇的4個指標中，由“您對地方人大的日常工作和決策的關注程度”和“您對居民/村民委員會日常工作和決策的關注程度”這兩個最高負荷的題項所構成的測度比開始所選擇的4個題項構成的測度更加可信。因此用這兩個題項構成了一個新的變量“公民性”，用來測量城市居民社會責任感的高低，如表5所示。

1.2.7 鹽度對誘變菌株產表面活性劑的影響將菌株按照5%的接種量接種于不同鹽度的無機鹽培養基中,分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、8%NaCl,在40℃、150 r/min條件下培養20 h,測定發酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B IT-TLM1為對照,比較誘變前后鹽度對菌株產生物表面活性劑的影響。

1.2.8 pH對誘變菌株產表面活性劑的影響 將誘變菌株按照5%的接種量接種于不同pH值的無機鹽培養基中,pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,在40℃、150 r/min條件下培養20 h,測定發酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B IT-TLM1為對照,比較誘變前后不同酸堿度對菌株產生物表面活性劑的影響。

2 結 果

2.1 BIT-TLM 1菌株生長曲線

B IT-TLM1菌株生長延滯期較短,10 h即可進入對數生長期,在20 h以后達到穩定期,測定此時發酵液的表、界面張力分別為29.29和0.61 mN/m,可見20 h為B IT-TLM1的最佳培養時間(圖1),該研究用培養20 h的B IT-TLM1發酵液進行誘變。

圖1 BIT-TLM1菌株生長曲線Fig.1 Growth curve for strain B IT-TLM1

2.2 紫外誘變BIT-TLM1再生株致死率曲線

利用紫外線對B IT-TLM1菌株進行誘變處理,其致死率與照射時間的關系曲線見圖2。從圖2可以看出,紫外線的處理時間與致死率之間存在明顯的正效應關系,隨著紫外線處理時間的延長,致死率逐漸升高。紫外線分別處理30 s和40 s時,致死率分別為78.3%和92.6%,處理50 s時,致死率為98.5%。因此,紫外線處理的時間控制在40 s可達到預期的致死率。

圖2 BIT-TLM1菌株紫外誘變的致死曲線Fig.2 Lethal curve ofUV mutagenesis for strain B IT-TLM1

2.3 高產表面活性劑菌株的篩選

將紫外誘變(紫外光照射40 s,致死率為92.6%)后的B IT-TLM1再生菌株(圖3、圖4)接種于藍色篩選培養基,40℃培養20 h,選取在篩選培養基上藍色暈圈直徑比原始菌株B IT-TLM1大的菌株共10株進入復篩(圖5)。

圖5 紫外誘變后的菌落形態Fig.5 Colonial morphology after UV mutagenesis

將初篩后的10株誘變菌株在40℃、150 r/min條件下培養20 h,按照1.2.3中②的方法計算表面活性劑產量,得到3株產量提高的菌株,標號為UV-6、UV-8、UV-10。

2.4 遺傳穩定性實驗

為了檢測誘變菌株UV-6、UV-8、UV-10產表面活性劑的性狀是否穩定,將上述3株菌與原始菌B IT-TLM1分別接入液體培養基中,連續培養7代,分別測定其表面活性劑產量(表1)。

表1 誘變菌株的遺傳穩定性測定結果Table 1 Genetic stability determination results ofmutant strains

由表1可知,UV-6與UV-8在連續傳代培養后產量不穩定,而UV-10的遺傳性能比較穩定。

2.5 碳源對誘變菌株UV-10產表面活性劑的影響

從圖6中可以看出,以糖蜜、蔗糖及固體石蠟為碳源時,誘變菌株UV-10表面活性劑產量均比B IT-TLM1高,其中糖蜜和葡萄糖是較佳的碳源,產量比BIT-TLM1分別提高了9.74%和9.22%,表明單糖比二糖及多糖對菌株代謝產表面活性劑的能力要好,誘變菌株UV-10能利用固體石蠟產表面活性劑,其能力與蔗糖相當,為高含蠟油藏利用微生物增產提供了保障。

圖6 碳源對誘變菌株UV-10表面活性劑產量的影響Fig.6 Effects of carbon sources on the surfactant production of mutant strain UV-10

2.6 氮源對誘變菌株UV-10產表面活性劑的影響

圖7 氮源對誘變菌株UV-10表面活性劑產量的影響Fig.7 Effects of nitrogen sources on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖7中可以看出,添加不同的氮源,誘變菌株UV-10表面活性劑的產量均比B IT-TLM1高。其中以硝酸鉀為氮源時,產量提高了5.66%;以無機氮源氯化銨為氮源時誘變菌株UV-10的表面活性劑產量為0.309 7 g/g菌體,比采用牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉在相同條件下更經濟,為在采油領域大規模應用提供了實驗依據;以有機氮源尿素為氮源時表面活性劑產量較低,但也比原始菌株產量(0.135 g/g菌體)提高了7.41%。

2.7 鹽度對誘變菌株UV-10產表面活性劑的影響

圖8 NaCl濃度對誘變菌株UV-10表面活性劑產量的影響Fig.8 Effects of NaCl concentration on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖8可以看出,原始菌株B IT-TLM1在1%NaCl濃度下表面活性劑的產量達到最大,為0.278 6 g/g菌體,而誘變菌株UV-10在2%NaCl下表面活性劑產量達到最大,比原始菌株BITTLM1提高了17.21%,表明誘變菌株UV-10最佳耐受的鹽度為2%,繼續添加鹽會影響產量,NaCl濃度超過2%產量急劇下降,鹽濃度超過5%時,菌幾乎不生長,高濃度的鹽會使微生物細胞脫水,代謝終止。隨著環境鹽度的改變,微生物要適應這種環境必須對外界的滲透壓做出相應的反應[11],推測誘變后的菌株UV-10在5%的鹽度下仍能生存,是因為它通過對自身的基因調控分泌了某些滲透壓保護劑,這可以從誘變后表面活性劑產量看出來。

2.8 pH對誘變菌株UV-10產表面活性劑的影響

圖9 pH對誘變菌株UV-10表面活性劑產量的影響Fig.9 Effects of pH value on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖9可以看出,誘變前后的菌株在5.0～9.0的pH值范圍內均生長,且在pH 7.0左右產表面活性劑的能力最強,原始菌株B IT-TLM1在pH 6.0時表面活性劑的產量為0.289 1 g/g菌體,而誘變菌株UV-10的產量在弱堿性pH 8.0下達到最佳,為0.309 7 g/g菌體,比誘變前提高了47.48%,經過紫外誘變,菌株可在弱堿性條件下代謝產表面活性劑,但pH達到10.0時表面活性劑產量僅為0.040 9 g/g菌體。

以上結果表明誘變菌株雖然能夠耐受一定范圍的pH波動,但是pH過高過低會導致溶液中滲透壓發生變化,從而導致微生物細胞內外環境的滲透壓平衡遭到破壞,進而對微生物的生長代謝產生抑制,嚴重的導致細胞死亡。因此,pH 8.0為誘變菌株最適產表面活性劑條件。

2.9 誘變菌株UV-10產表面活性劑的初步定性分析

利用1.2.3中②的方法,將原始菌株B ITTLM1、誘變菌株UV-10的代謝產物進行酸沉[12],提純后經薄層色譜(TLC)分析,UV-10所產生的生物表面活性劑與茚三酮劑作用后顯紫紅色(結果未示)[13],與標準品結果相對照,初步判定誘變菌株UV-10所產生的是一類脂肽類的生物表面活性劑。

3 討 論

為篩選出生物表面活性劑高產菌株,本試驗對1株產表面活性劑的菌株B IT-TLM1進行了紫外誘變選育,在藍色凝膠平板上通過兩步篩選及遺傳穩定性研究得到1株高產表面活性劑的誘變菌株UV-10,在150 r/min,pH 8.0,40℃培養20 h,其最大產量達到0.309 7 g/g菌體,比原始菌株B IT-TLM1的產量(0.283 6 g/g菌體)提高了9.2%。此前,Lin等[14]在Bacillus lichenifor m isJF-2培養液中加入誘變劑,通過一系列的篩選,最后得到1株變異株Bacillus lichenifor m isKGL11,它產生的生物表面活性劑濃度為390 mg/L,是Bacillus lichenifor m isJF-2產生的生物表面活性劑濃度的12倍,而且生物表面活性劑種類相同。本實驗采用紫外誘變選育,獲得了較好的效果,若結合其他誘變方法的使用,菌株產表面活性劑的能力有待于進一步提高,同時這株從新疆塔里木篩選出來的菌株,其理化性質、分類地位、所產生物表面活性劑的種類,對新疆微生物菌群分布研究也有重要意義,其相關的內容尚需進一步研究。

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