應用生物反應器建立人用凍干狂犬病疫苗(Vero細胞)生產工藝的研究

李志強,袁延寶,鄭淑媛,代長海,張夫坤,顧丹陽,戚鳳春

(長春生物制品研究所,吉林長春 130062)

狂犬病是一種人獸共患疾病,由于狂犬病在發病以后無藥可治,因此死亡率達到100%,對于被狂犬咬傷的人群,最有效的方法是接種狂犬疫苗,我國每年大約有1 000萬～1 200萬人接受狂犬病毒暴露后的疫苗接種[1]。由于近年來國內狂犬病的發生率有所升高,因此國家藥監部門對狂犬疫苗的質量要求越來越高。人用狂犬病疫苗的生產,病毒收獲液的毒力滴度是影響疫苗效價的一個關鍵因素,由于采用轉瓶進行細胞培養所收獲的病毒原液毒力較低,經純化后很難生產出合格的狂犬病疫苗,而通過生物反應器對細胞進行高密度的培養,可以制備出高毒力的病毒收獲液,從而提高狂犬病疫苗的效價。本試驗以生物反應器加入片狀載體對細胞進行高密度培養,制備出高毒力滴度的病毒收獲液,經純化后生產出合格的凍干人用狂犬病疫苗,疫苗經檢定后各項指標均符合規程要求。此工藝適于工業化生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與毒種 ①Vero細胞,由本所疫苗一室提供;②aG株;由本課題組從狂犬病毒豚鼠腦毒種經Vero細胞適應后獲得。毒種毒力為8.0 lgLD50/mL。

1.1.2 儀器設備 ①生物反應器:New Brunswick Scientifc.CO. INC,USA生產,容積15 L,工作容積11.25 L,以壓縮空氣、O2、N2、CO2調控DO和pH。使用前DO及pH傳感器標化準確[2-4];②超濾器:Milliber公司生產,膜包分子量為10萬;③層析柱:采用Sepharose4FF柱色譜法純化,Sepharose4FF由GE Healthcare生產[5];④凍干機:國產小型凍干機。

1.1.3 試劑與載體 ①細胞培養液:199/EBSS美國海克隆實驗室公司生產,補加10%(細胞生長期)、1%(細胞維持期)的小牛血清;②小牛血清:400 mL/瓶、武漢三利生物技術有限公司生產;③片狀載體:由Jiffy Packaging Company生產,加入量為50 g/L。

1.2 方法[6-7]

1.2.1 培養條件 ①批次培養:細胞培養罐接種細胞后,經37℃培養3 d,再接種狂犬病毒,經33℃培養3 d,開始收獲病毒收獲液,每24 h收獲一個細胞培養罐工作體積的病毒收獲液。收液時全部吸出,然后加入新的培養液繼續培養;②連續灌流培養:細胞培養罐接種細胞后經37℃培養3 d,再接種狂犬病毒,經33℃培養3 d,開始收獲病毒收獲液,用蠕動泵收取病毒收獲液的同時加入新的培養液,每24 h收獲一個細胞培養罐工作體積的病毒收獲液。

1.2.2 病毒收獲液毒力測定 用Reed-Muench計算LD50。

1.2.3 病毒收獲液超濾純化 檢定合格的病毒收獲液經超濾濃縮60倍、80倍,經β-丙內酯滅活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙內酯經37℃水解2 h),滅活合格的濃縮液通過層析柱進行純化。

1.2.4 疫苗的配制和凍干 純化后的病毒液,加入適量的人血白蛋白作為保護劑,即為原液,取原液按20%的比例加入賦型劑進行分裝凍干,制備出凍干狂犬病疫苗。

1.2.5 疫苗效價測定 用N IH法測定效價。

2 結果與分析

2.1 培養方式對病毒收獲液毒力滴度的影響

圖1 2008-2批次培養病毒收獲液毒力曲線Fig.1 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-2)after batch culture

圖2 2008-3連續灌流病毒收獲液毒力曲線Fig.2 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-3)after continuous flow culture

從圖1、圖2看出,批次培養與連續灌流培養2種培養方法在收獲的病毒收獲液的毒力滴度上沒有明顯區別,收獲前3次病毒收獲液的毒力逐漸上升,4～7 d達到最高水平,在收獲20 d后毒力開始下降,到25 d時明顯降低。細胞計數:兩種培養方式細胞數均在6×106個/mL以上。

2.2 不同濃縮倍數和純化

病毒收獲液超濾濃縮采用60倍和80倍兩種濃度,濃縮液經β-丙內酯滅活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙內酯經37℃水解2 h)后,通過Sepharose4FF層析柱進行純化。

2.3 凍干疫苗賦型劑的選定

凍干賦型劑采用右旋糖酐、海藻糖、甘露醇、蔗糖配制,經過試驗確定最終濃度,為保證疫苗的加入量,4種賦型劑成分的配制濃度接近飽和濃度,經過凍干后的疫苗呈白色疏松狀、無塌陷,復溶后為澄明液體,無異物。

2.4 液體疫苗與凍干疫苗的效價比較

結果見表1、表2。

表1 病毒收獲液經60倍濃縮后效價結果Table 1 Titer of harvested virus liquid after 60-fold concentration

表2 病毒收獲液經80倍濃縮后效價結果Table 2 Titer of harvested virus liquid after 80-fold concentration

凍干疫苗與液體疫苗相比效價下降小于0.5 IU/劑。

2.5 凍干疫苗熱穩定試驗結果

將凍干后的人用狂犬病疫苗置37℃28 d,然后與在4℃保存的凍干疫苗同時進行效價試驗。實驗結果見表3、表4。

表3 60倍濃縮凍干苗的熱穩定性實驗結果Table 3 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 60-fold concentation

表4 80倍濃縮凍干苗的熱穩定性實驗結果Table 4 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 80-fold concentation

試驗結果顯示:熱穩定試驗后疫苗與對照疫苗相比效價下降小于0.8 IU/劑。

3 討 論

應用15 L細胞培養罐,使用片狀載體,加入量為50 g/L,在細胞培養中細胞的密度可以達到6×106個/mL以上,在細胞接種3 d后,再接種狂犬病毒,將細胞生長液換成維持液,再經過3 d后開始收獲病毒收獲液。在收獲病毒收獲液的過程中采用批次收獲和連續灌流培養收獲兩種方式進行狂犬病毒收獲液的收集,每24 h收獲一個細胞培養罐工作體積,可以連續收獲25 d(次),病毒收獲液的毒力滴度可以達到7.0～8.0 lgLD50/mL之間。

檢定合格的病毒收獲液經濃縮、滅活和純化后,加入適量人血白蛋白作為保護劑即為原液,經稀釋后即為液體狂犬病疫苗,液體狂犬病疫苗加入賦劑型后,經凍干后即為凍干狂犬病疫苗。

疫苗經效價檢定后可以看出,病毒收獲液經60倍和80倍2種倍數濃縮后,制備的疫苗效價均可以達規程要求,疫苗的其他各項指標經檢定均達到生產規程要求。凍干疫苗與液體疫苗相比效價下降小于0.5 IU/劑,凍干疫苗經熱穩定性試驗后效價降低小于0.8 IU/劑。

此生產工藝與傳統的轉瓶生產工藝相比,具有染菌率低、單位體積細胞密度大、所收獲的病毒原液毒力滴度高及脫落細胞少等優點。這樣,在疫苗的生產中可以提高疫苗的質量和產量,同時可以使生產成本大大降低。本生產工藝與采用微載體的罐培養工藝相比,優點是由于使用的片狀載體可以將細胞固定在一個相對平穩的環境中,因此不會受到攪拌系統剪切力的影響而造成細胞脫落。使用微載體時培養罐的攪拌速度一般不超過100 r/min,如果高于這個轉速就可能造成細胞的脫落,而采用片狀載體進行細胞培養時,攪拌速度可以達到180～220 r/min,從而使各種氣體、細胞培養液的交換更加充分,更加有利于pH和DO的調控,同時也具有在病毒收獲液中脫落細胞少的優點,有利于疫苗的純化。此工藝完全適合用于大規模人用凍干狂犬疫苗的生產。

[1] 張永振.中國狂犬病流行病學特征及防治建議[D].全國人畜共患病學術研討會論文集,2006:64-68.

[2] 李志強,官桂范,王研,等.應用生物反應器連續培養基因重組CHO細胞的研究[J].生物工程學報,1993,9(2):163-165.

[3] 王樹君,代長海,張瑩,等.用微載體系統培養VERO細胞生產高滴度狂犬病毒液[J].中國生物制品學雜志,2004,17(6):380-382.

[4] 官桂范,李志強,王研,等.30 L生物反應器連續灌流培養重組CHO-C28細胞表達HBsAg的研究[J].微生物學免疫學進展,1999,27(4):45-50.

[5] 劉國詮.生物工程下游技術[M].北京:化學工業出版社,1993:47-57.

[6] Heath C.,Kiss R.Cell Culture ProcessDevelopment[J].Advances in Process Engineering,2007,23:46-51.

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