HPLC法測(cè)定黃連藥材及其炮制品中主要生物堿的含量

陽(yáng) 勇， 李鐵剛， 朱晶晶， 鐘國(guó)躍， 王 欣， 王智民， 武小赟， 羅維早*

(1.重慶市中藥研究院，重慶400065;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700)

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云連 Coptis teeta Wall.的加工品［1］，常用的炮制品有黃連飲片、酒黃連、姜黃連、萸黃連。2005年版《中國(guó)藥典》一部黃連含量測(cè)定項(xiàng)下僅以小檗堿作為對(duì)照，采用薄層色譜掃描法測(cè)定，且僅規(guī)定了黃連藥材中小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)。小檗堿雖是黃連的活性成分之一，但在黃柏、三棵針、十大功勞、唐松草等植物中都存在，且目前已有作為醫(yī)藥原料藥的小檗堿生產(chǎn)上市，顯然以此作為黃連唯一的指標(biāo)成分客觀性和專(zhuān)屬性較差;薄層色譜掃描法影響因素多，操作較復(fù)雜，已逐漸被HPLC替代進(jìn)行含量測(cè)定;黃連炮制品系黃連用藥的主體，故不僅要求對(duì)黃連藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，更需要制定其炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)［2-4］的基礎(chǔ)上，采用液相色譜法，對(duì)不同來(lái)源、批次的黃連藥材及其炮制品進(jìn)行了含量測(cè)定，并制定了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

島津LC－2010型液相色譜儀(含自動(dòng)進(jìn)樣器，Class VP6.1－sp1色譜系統(tǒng));三用紫外線(xiàn)分析儀(上海顧村電光儀器廠(chǎng));KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);AUW220D型電子天平(十萬(wàn)分之一，日本島津公司);BS224S型電子天平(萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司);

鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào):110732—200506)，鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713—200208)，鹽酸藥根堿對(duì)照品(批號(hào):0733—200005)，以上3個(gè)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;鹽酸表小檗堿對(duì)照品、鹽酸黃連堿對(duì)照品由本院藥化室提供，純度98%以上;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。黃連藥材及其炮制品來(lái)源于2010年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)目，均經(jīng)重慶市中藥研究院生藥室鐘國(guó)躍研究員鑒定確認(rèn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相為乙腈－50 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(50:50)(混合液中加15 mmol/L十二烷基硫酸鈉，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0);流速:0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):345 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)均不低于5 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，用甲醇制成每 1 mL 含有9、17、12、60 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－鹽酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL至10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 樣品測(cè)定 取黃連藥材及其炮制品樣品，照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1～2，結(jié)果見(jiàn)表1～5(帶*的數(shù)據(jù)為Q檢驗(yàn)和G檢驗(yàn)的不合格數(shù)據(jù))。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference standards

圖2 樣品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of sample

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法中的Q檢驗(yàn)法和G檢驗(yàn)法對(duì)極值及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，淘汰不合格數(shù)據(jù)，將剩余值求平均值。黃連藥材的鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿平均值分別為0.93%、1.85%、1.45%、6.01%;黃連飲片的鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿平均值分別為0.73%、1.50%、1.13%、5.02%;酒黃連飲片的鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿平均值分別為0.60%、1.18%、0.97%、4.26%;姜黃連飲片的鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿平均值分別為0.65%、1.32%、0.99%、4.46%;萸黃連飲片的鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿平均值分別為0.67%、1.32%、1.06%、4.60%。再綜合分析，規(guī)定限度:確定黃連藥材含鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿分別不得少于0.93%、1.80%、1.45%和6.00%;黃連飲片、酒黃連、姜黃連和萸黃連中鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量分別不得低于0.70%、1.50%、1.10%和5.00%。在此限量下，合格率均為80%左右。

表1 黃連藥材的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

表2 黃連飲片的含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3 討論

3.1 黃連及其炮制品中生物堿類(lèi)化學(xué)成分復(fù)雜，在研究過(guò)程中，我們考察了流動(dòng)相的pH、流速的變化、柱溫的變化及樣品不同制備方法、溶劑用量、不同提取時(shí)間;根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定了本研究中樣品處理?xiàng)l件及色譜條件。本法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確靈敏，重復(fù)性好，使用范圍廣，可用于檢驗(yàn)、評(píng)價(jià)黃連、黃連炮制品及其相關(guān)產(chǎn)品。

3.2 現(xiàn)市場(chǎng)“黃連”藥材中，絕大多數(shù)為“味連”;“雅連”與“云連”栽培規(guī)模極小，產(chǎn)量極低，主要以野生為主。本實(shí)驗(yàn)收集的市場(chǎng)黃連及其炮制品經(jīng)原植物鑒定主要為“味連”，而“雅連”(四川洪雅)和“云連”(云南貢山)藥材僅在原栽培地區(qū)分別采集了各一批。含量測(cè)定結(jié)果表明雅連和云連中生物堿成分的含量與味連相比存在較大差異，特別是其中的鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀含量相當(dāng)?shù)停试诖_定限度時(shí)未將二者計(jì)算在內(nèi)，文章中列出，供參考對(duì)照。

表3 酒黃連飲片的含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

表4 姜黃連飲片的含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3.3 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連藥材及其各種炮制品的含量測(cè)定結(jié)果可知，黃連藥材及黃連飲片、酒黃連、姜黃連、萸黃連中4種生物堿的含量高低順序均為:鹽酸小檗堿>鹽酸黃連堿>鹽酸巴馬汀>鹽酸表小檗堿;同一來(lái)源的炮制品中，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均含量高低次序均為:萸黃連>姜黃連>酒黃連。相對(duì)黃連藥材而言，炮制品中各生物堿的含量均有所減少而以酒制樣品減少最多，這可能是部分生物堿在炮制過(guò)程中損失掉，而黃酒利于黃連中生物堿的溢出，因此減失較多而含量降低。

表5 萸黃連飲片的含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3.4 根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一來(lái)源的不同炮制品中巴馬汀、小檗堿、表小檗堿、黃連堿4種生物堿具有相近的含量，以至于不分炮制品種類(lèi)，只要是同一來(lái)源的黃連、黃連飲片、酒黃連、姜黃連及萸黃連可能均為含量合格或含量不合格的樣品。對(duì)此有待進(jìn)一步深入的研究。

3.5 由上表中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，各樣品中鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量存在一定的比例關(guān)系，不合格的樣品也是如此，對(duì)此將作進(jìn)一步的討論研究。

3.6 本次研究結(jié)果表明，除鹽酸小檗堿外，其他幾種生物堿的含量也較高，顯然，2005版《中國(guó)藥典》僅以小檗堿作為對(duì)照，客觀性、準(zhǔn)確性和專(zhuān)屬性均不強(qiáng)，將其他3種主要生物堿列為含量限度指標(biāo)有利于藥材及炮制品的質(zhì)量控制，提高了藥材及炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:213.

［2］樊冬麗，廖慶文，鄢 丹，等.黃連不同炮制品中生物堿類(lèi)成分的比較研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(4):276-279.

［3］王克英，方玲芬.酒黃連中小檗堿HPLC含量測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(22):2443-2444.

［4］張紅梅，程雪梅，王長(zhǎng)虹，等.黃連中生物堿提取工藝的正交試驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(8):588-590.

［5］劉 芳.黃連品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究及其應(yīng)用［D］.四川:四川大學(xué)，2005.